論文發表 | 在肺纖維化領域的重要新發現，被雜志審稿人評價可以“move the field forward”

文獻信息

近日，廣州醫科大學呼吸疾病國家重點實驗室蘇金教授課題組在肺纖維化領域有重要新發現，相關研究成果以“Intracellular Hydroxyproline Imprinting Following Resolution of Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis”為題發表在 Eur Respir J（IF=16.67）。該研究論文的第一作者為貴州醫科大學宋盛仁博士和廣州醫科大學呼吸疾病國家重點實驗室的傅振利博士等，通訊作者為蘇金教授和鐘南山院士。

該研究借助多種新技術方法，揭示了肺纖維化經典動物模型存在“胞內羥脯氨酸印記”現象，不僅平息了該領域關于動物模型長達20年的爭議，還為肺纖維化嚴重程度評價提供了多維度技術手段，被雜志審稿人評價可以“move the field forward”。

文獻背景：

1、特發性肺纖維化現狀

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）的特征是異常的傷口愈合反應，導致肺內細胞外基質(ECM)過度沉積，從而導致勞力性呼吸困難、慢性咳嗽、肺功能下降和生活質量受損等癥狀。肺纖維化疾病的全球致死率高，藥物研發失敗率高，在過去10年，145項針對肺纖維化的藥物研發僅有2項[1]。IPF的五年存活率僅為25%，確診患者中位生存期僅為3-5年，因此被稱為“不是癌癥的癌癥”[2]。到目前為止，盡管吡非尼酮和尼達尼布這兩種藥物都減緩了疾病的進展，但它們不能治愈IPF，并且需要增加新的治療方法來提高患者的生存率。

2、肺纖維化臨床前模型的未來前進方向

由于IPF具有與年齡相關的特發性和高度復雜的基礎病理生物學特性，因此從整體上來說，其臨床前動物建模本身具有一定的挑戰性。迄今為止，沒有任何一種動物模型能夠完全概括人類IPF病程發展的所有方面。但無論選擇哪種臨床前模型，都需要對肺纖維化進行準確的分析。纖維化終點評估包括膠原蛋白含量的生化定量分析（羥脯氨酸分析），纖維化分布的組織學評估以及其他參數，例如基因表達、肺功能以及放射成像等。

為什么大量的IPF臨床藥物試驗都未能取得成功，在動物模型中有效的藥物中，90%在臨床上被證明無效。目前肺纖維化在臨床上主要依據高分辨率CT（HRCT）掃描和肺活檢確診，越來越多的臨床前模型研究建議采用臨床肺纖維化的評估方法，減少藥物在臨床前與臨床研究的結果差異。博來霉素是誘導動物肺纖維化的常用藥物。ATS研討會報告提出，氣管內博來霉素滴注模型是可用于臨床前測試最典型的動物模型[3]，盡管由博來霉素模型誘導肺纖維化的組織病理學模式與普通型間質性肺炎（UIP）并不完全一致。廣州醫科大學呼吸疾病國家重點實驗室肺纖維化學組將micro-CT（設備型號：SNC-100，平生醫療科技（昆山）有限公司）影像學技術結合多種技術手段平息了以往20年肺纖維化研究領域關于小鼠肺纖維化自愈與否的爭論，揭示了纖維化自愈的分子機制，同時為抗纖維化藥效學評價提供了重要方法學。在肺纖維化動物模型及評價方法中，羥脯氨酸含量測定是肺纖維化程度評價的 “金標準”[3]。但羥脯氨酸含量不僅無法避免動物個體差異所致結果偏差，還無法判斷纖維化主要指標膠原的存在狀態。因此，肺纖維化動物模型還有待進一步提高和優化其評估的手段。

肺纖維化動物模型通常采用終點測量方法如膠原含量、組織學Ashcroft評分[4]、基因表達、組織學、肺功能等生化評估來評估肺纖維化程度和藥物療效。盡管這些終點測量提供肺纖維化水平有價值的評價結果，但它們不能提供肺纖維化的全貌信息。目前大多數肺纖維化研究很少測量相關的功能指標，如肺功能下降或氣體交換受損，而這些變化是 IPF 臨床上的重要標志，部分原因是很難在小鼠中穩定地測量這種變化。

為了評估治療方案中干預措施的真正作用，作者需要知道在給藥時是否、何時以及有多少纖維化和炎癥存在，因此只能通過使用非侵入性技術，如微計算機斷層掃描 (μCT) 成像實現。高分辨率 micro-CT 成像可用于動態和無創地用于動物模型的診斷和監測肺纖維化狀態，是研究和量化肺纖維化等肺部疾病負擔的一項特別出色的技術，它可確立其對標準終點評估（如組織學和羥脯氨酸分析）的非侵入性附加信息。Micro-CT能夠單獨縱向可視化和量化每只動物的炎癥和纖維化過程，從而確定治療何干預的窗口。因此，肺纖維化臨床前研究應建議從放射成像入手，在活體內觀測藥物干預對肺纖維化的影響。肺纖維化發病過程中大量的成纖維細胞聚集和分泌ECM，使肺泡腔及肺間質結構在放射成像上與含空氣的正常肺泡有顯著的差異，基于這一特點，micro-CT的后續影像分析為作者了解臨床前動物模型的肺泡通氣含量情況，或進一步分析肺纖維化正常通氣、通氣不良和不通氣的肺內情況提供了更直觀和準確的數據。因此可作為作者整體評估肺纖維化動物模型的優先選擇標準。

實驗方法：

使用雄性C57BL/6J小鼠（6-8周）。博來霉素溶解于無菌0.9%生理鹽水中，每只動物氣管滴注2.0mg/kg.對照組滴注生理鹽水。將小鼠隨機分為七個體重匹配的實驗組：（1）博萊霉素，第1周；（2） 博萊霉素，第2周；（3） 博萊霉素，第3周；（4） 博萊霉素，第4周；（5） 博萊霉素，第10周；（6） 博萊霉素，第16周；（7）生理鹽水。為了描述博萊霉素誘導的肺纖維化的時間過程，第（6）組小鼠在博萊霉素滴注前和滴注博萊霉素后第1、2、3、4、7、10、12和16周，使用顯微計算機斷層掃描（micro-CT）分析（平生醫療科技（昆山）有限公司，設備型號：SNC-100，中國）獲取連續動態CT圖像。

用異氟醚麻醉小鼠，使用 Super Nova CT（平生醫療科技（昆山）有限公司，型號：SNC-100）獲取的，并使用Avatar軟件分析（中國平生醫療科技（昆山）有限公司）進行分析。對軸位和冠狀位圖像進行分析，以確定相同的體內體征（如右支氣管分叉），這些體征被定義為纖維化區域。

實驗結果：

肺部的顯微CT圖像。在博萊霉素給藥后不同時間點獲取軸向（上排）和相應冠狀（下排）顯微CT圖像，劑量為2.0毫克/千克。在每個時間點，用紅方標記小鼠右支氣管的分叉，以確保在所有CT圖像中選擇相同位置的區域.

肺通氣的定量CT容積評估。a） 第4周博萊霉素治療小鼠肺部CT圖像的代表性彩色圖。藍色：正常充氣區域；黃褐色：通氣不良的區域；紅色：非充氣區域。b） 博萊霉素損傷后指定時間點代表性小鼠肺CT充氣容積的動態百分比。c） 肺CT充氣量的統計計算。

總結：

通過評估肺纖維化動物模型中的生化定量和臨床相關 CT 和肺功能衍生定量來彌合臨床前和臨床研究之間的差距，將對確定治療靶點和化合物的研究效率產生關鍵影響。放射影像技術以及更多的臨床相關性為研究人員提供了縱向檢查單個動物肺纖維化進展的機會，而不必犧牲許多動物來檢查纖維化。這些方法的應用更好地模擬了評估臨床前肺纖維化模型的臨床相關終點指標，可能意味著新的治療方法更多地能夠從體內模型走向臨床轉化，為肺纖維化的患者治療帶來新的希望。

參考文獻：

[1]   KOLB P, UPAGUPTA C, VIERHOUT M, et al. The importance of interventional timing in the bleomycin model of pulmonary fibrosis [J]. The European respiratory journal, 2020, 55(6):

[2]   MIKOLASCH T A, GARTHWAITE H S, PORTER J C. Update in diagnosis and management of interstitial lung disease  [J]. Clin Med (Lond), 2017, 17(2): 146-53.

[3]   JENKINS R G, MOORE B B, CHAMBERS R C, et al. An Official American Thoracic Society Workshop Report: Use of Animal Models for the Preclinical Assessment of Potential Therapies for Pulmonary Fibrosis [J]. American journal of respiratory cell and molecular biology, 2017, 56(5): 667-79.