藏紅花酸（crocetin）是藏紅花的主要活性成分之一，在中草藥、食用色素和染料工業中有著廣泛的應用。

研究表明，藏紅花酸及其衍生物有益于治療多種疾病，包括癌癥、冠心病和高血壓。目前，藏紅花酸可從藏紅花柱頭和梔子中提取、分離和純化，然而藏紅花年產量低、種植成本高(1公斤藏紅花的成本約為200美元)，同時，藏紅花中藏紅花酸等天然化合物的含量通常較低，這也導致了傳統提取和純化工藝的高成本。

幸運的是，上述問題可以通過生物合成技術的發展來解決，但從頭生物合成實現藏紅花酸的商業化生產仍有很長的路要走，目前迫切需要一種更有效和可持續的生物合成藏紅花酸及其類似物的策略。

 

近日，來自天津大學的肖文海老師課題組在《ACS Sustainable Chemistry Engineering》發表了主題為“One-Pot Efficient Bioconversion of Crocetin from Zeaxanthin via a Dual-Enzyme System”的研究論文，首次創建了藏紅花酸的一鍋法體外合成方式。
 

通過優化的蛋白表達和反應系統，以及類胡蘿卜素裂解雙加氧酶2(CsCCD2-M1 (R192F/S323A))和醛脫氫酶(SynALD)組成的雙酶系統，從玉米黃質中生物合成藏紅花酸。但是由于CsCCD2-M1和SynALD活性失衡，導致副產物3-HACA（3-hydroxy-β-apo-8′-carotenoic acid）的嚴重積累。研究人員進一步通過以6∶1的摩爾比和優化的雙酶反應條件，完全去除了副產物3-HACA。最終將優化后的體系放大10000倍后，在臺式生物反應器（迪必爾生物）中進行藏紅花酸的放大合成，結果顯示藏紅花酸的生物合成效率為1.48 mg/L/h, 2h內轉化率為80.8%。此外，經過三次循環后，殘余酶系統仍保留34%以上的酶活性。本研究不僅提供了一種可持續的體外生產藏紅花酸的方法，而且為快速構建一鍋法合成具有復雜結構的高價值化合物提供了新的思路。

 

具體的實驗研究路線為：

1）CsCCD2-M1和SynALD表達系統的建立

 

溫度和誘導劑濃度是對蛋白可溶性表達的兩個關鍵因素，研究人員首先測試了CsCCD2-M1和SynALD在不同誘導溫度和誘導劑濃度下的表達，結果如圖1所示，表達CsCCD2-M1和SynALD的最佳IPTG濃度和溫度分別為0.1μM和16℃。分子伴侶的主要功能是防止新合成的多肽鏈和組裝的亞基聚集形成非功能結構。同時，分子伴侶還參與蛋白質的轉運、錯誤折疊的降解和蛋白質聚集的抑制，它在維持細胞內蛋白穩態中起著至關重要的作用。因此，研究人員嘗試將伴侶質粒pGRO7與CsCCD2-M1和SynALD共表達，以提高它們的可溶性表達。如圖2a、b SDS-PAGE結果所示，分子伴侶蛋白的共表達顯著提高了CsCCD2-M1和SynALD的可溶性表達。最終，在誘導溫度為16℃、誘導劑濃度為0.1μM、添加分子伴侶的條件下，能夠有效地增強了蛋白的可溶性表達。
 

圖1 誘導劑濃度和誘導溫度對蛋白表達的影響

（a）不同濃度的IPTG對于CsCCD2-M1表達的影響

（b）不同溫度對于CsCCD2-M1表達的影響

（c）不同濃度的IPTG對于SynALD表達的影響

（d）不同溫度對于SynALD表達的影響

 

圖2 分子伴侶pGRO7對CsCCD2-M1和SynALD表達的影響

 

2）CsCCD2-M1催化條件的優化

 

pH和反應溫度是酶反應過程中的兩個重要因素，此外，Fe2+也是CsCCD2-M1催化活性中心的重要組成部分。因此研究人員通過調節pH、溫度和FeSO4的濃度來優化CsCCD2-M1的反應條件。向反應系統中加入5μM的玉米黃質，在不同的反應條件下反應2h，通過反應前后玉米黃質含量的變化來確定玉米黃質的轉化率。從圖3（b、c、d）中可以看出在30℃、pH 8.0和0.3μM Fe2+的添加量的條件下，藏紅花酸二醛的收獲率最高，同時將其確定為后續實驗的實驗條件。
 

圖3 一鍋法合成途徑中CsCCD2-M1催化條件的優化

（a）以玉米黃質為底物的CsCCD2-M1反應途徑

（b）pH對CsCCD2-M1活性的影響，實驗溫度為30℃

（c）溫度對CsCCD2-M1活性的影響，實驗pH為8.0

（d）鐵離子對CsCCD2-M1活性的影響，實驗溫度和pH分別為30℃、8.0

 

3）用于一鍋法合成的CsCCD2-M1/SynALD雙酶調控模式

 

從玉米黃質到藏紅花酸的生物合成途徑中最主要的兩步分別由CCD2和ALD催化完成。為了建立兩步反應體系和確定最佳的底物-酶的添加比，研究人員在200μL的反應體系中，加入5μM的玉米黃質，然后添加1μM的CsCCD2-M1和SynALD，深入分析反應6h內底物和產物的變化。如圖4(a)所示，玉米黃質被快速消耗，藏紅花酸和副產物3-HACA不斷積累；中間產物3-HAC也有少量積累，但隨即被迅速轉化。反應2h后，底物玉米黃質和中間產物3-HAC被完全消耗，反應體系中只有最終產物藏紅花酸和副產物3-HACA，大約有17%的副產物未被轉化。然后，研究人員通過分析CCD2和ALD的作用機制，推導出如圖4（b）所示的反應途徑，并進行了相應驗證，最終分析副產物的產生可能是由于兩酶的催化活性不對等所致，并進一步評估了CsCCD2-M1和SynALD的相對酶活性，如圖4（c）所示，SynALD的催化效率是CsCCD2-M1的6倍。當CsCCD2-M1和SynALD以6:1的摩爾比加入時，3-HACA在2小時內被消除(圖4d)。
 

圖4 藏紅花酸合成的最佳酶添加比

（a）以5μM的玉米黃質為底物，添加1μM的CsCCD2-M1和SynALD，6h內的反應過程

（b）以玉米黃質為底物體外合成藏紅花酸的過程

（c）順序添加1 μM的CsCCD2-M1和以5 μM玉米黃質為底物的SynALD反應過程。

（b）以5 μM玉米黃質為底物，加入1 μM CsCCD2-M1和0.17 μM SynALD, 6 h內的反應過程。

 

4）一鍋法合成藏紅花酸的放大

 

基于上述優化體系，研究人員將反應體系放大100倍。在該反應體系中，為了避免副產物3-HACA的產生，CsCCD2-M1和SynALD的添加比為6：1，最終計算出藏紅花酸的轉化率約為80.7%（圖5 b）。同時，為了降低反應成本，提高酶在反應體系中的利用率，研究人員將酶反復收集并利用（圖5 a），并對回收的酶進行了活性檢測，如圖5b、c、d所示，三輪反應中藏紅花酸的轉化率分別為80.7%、58.1%和34.1%。

   
為了進一步實現藏紅花酸的大規模生產，研究人員將反應體系擴大到10000倍至2.0L（圖6），并對目標產物藏紅花酸進行了分離、定量和表征。最終獲得5.92mg的藏紅花酸，其純度可達99%，且藏紅花酸的轉化率為80.8%，制備回收率為76.3%。

 

圖5 一鍋法合成藏紅花酸的多輪放大

（a）酶在反應體系中回收的操作流程示意圖

（b-d）三輪以玉米黃質為底物合成藏紅花酸的反應

（e）藏紅花酸的LC-MS及1H NMR檢測結果

 

圖6 藏紅花酸在臺式反應器（迪必爾生物）的放大合成

參考文獻：

Mengying Shan, Mingdong Yao, Ying Wang, Wenhai Xiao, and Ying-jin Yuan. One-Pot Efficient Bioconversion of Crocetin from Zeaxanthin via a Dual-Enzyme System. ACS Sustainable Chemistry & Engineering 2023 11 (23), 8615-8623