本文要點：活體動物的生理學研究常常具有侵入性，受到身體約束、麻醉甚至安樂死的限制。使用不受物理和化學約束的非侵入性方法在臨床前研究被廣泛應用。如計算機斷層掃描(CT)和磁共振成像(MRI)，但由于時間分辨率低、視野要求低以及對造影劑的靈敏度有限，其在自由移動的小鼠中的應用有限。光學技術與熒光劑偶聯能夠提供行動自由老鼠的結構、功能、遺傳或代謝對比，已經作為替代方案出現。短波紅外(SWIR, 1,000-1,700 nm)熒光成像在可視化小鼠生物結構方面表現出色。

SWIR區域的光物理特性使其成為了光學體內成像的最佳方案，許多SWIR發射探針被開發應用于生物醫學領域，包括臨床批準的吲哚菁綠(ICG)和相關的有機染料，以及量子點、碳納米管和稀土摻雜納米顆粒等用于實現SWIR成像。此外，SWIR敏感相機技術的進步提高了成像的分辨率、靈敏度和效率，如基于InGaAs的探測器。

SWIR成像已被廣泛用于小鼠血管檢測、代謝活動評估、可視化淋巴血管和生命體征監測等，但大多數應用于麻醉動物。相關研究表明SWIR成像能夠應用于自由活動的小鼠。本篇文章結合高對比度SWIR發射熒光團和SWIR檢測技術，實現了多達4個不同通道的實時多通道成像記錄，在自由活動的小鼠中實現了非侵入性腦活動和腦外周器官串擾成像，具有巨大潛力。

1. 自由行為小鼠光學成像的實驗策略

本篇文章中作者使用了ICG, JuloChrom5, Chrom7和JuloFlav7，可以在1-10 ms的曝光時間范圍內進行非侵入性的清醒小鼠成像。同時，為了獲得最佳的染料激發，熒光團吸收光譜與多色實驗中使用的激光線相結合（圖1）。

圖1

除水溶性的ICG外，其它染料都被包裹在脂質膠束中用于體內注射。為了檢測清醒小鼠器官的SWIR熒光發射，作者使用了一個提供小鼠全身視野的35 mm F/1.4鏡頭和一個最大幀率為300幀每秒(fps)、分辨率為640 × 512像素的單色InGaAs探測器。檢測窗口可以選擇1000或1150納米的長通濾光片，這取決于每個實驗中使用的熒光團和激光線。

2. 行為自由的小鼠成像的快速采集

對清醒和自由移動的小鼠進行成像需要高時間和空間分辨率以及有利的對比度來解析生物參數，同時考慮動物運動。例如，在自然運動中的老鼠搖晃和搔頭，作者發現10毫秒(相當于100 fps)的暴露時間對分辨主要的熒光標記血管是必要的。然而，一些較小的血管只能在3ms時觀察到（相當于300 fps）（圖2）。

圖2. 3ms時獲取的單幀圖像，以及該幀圖像與相鄰幀圖像的比較

3. 在自由行為小鼠中標記和可視化主要血管

為了使血管標記，長循環膠束配方的Chrom7被靜脈注射，注射后45分鐘成像。作者觀察到信號集中在眼眶周圍的主要血管、顱底和后肢(背側視圖;圖3)。圖像使用968 nm光源和1000 nm長通濾波，以300 fps的速度獲得。同時將視頻顯示速度從300幀/秒降至30幀/秒;然后用慢動作顯示鼠標的快速運動，大多數血管仍然可以分辨出來。這說明SWIR成像不僅可以保持全小鼠視野，還能分辨小鼠的精細結構。

圖3. SWIR熒光血管成像小鼠在成像室中自由運動

4. 熒光團多路復用在多通道對社會互動小鼠進行正交成像

多路復用成像是臨床前成像研究的關鍵特征。作者利用了激發-多路復用概念:熒光團激發匹配的激光波長以交替順序打開，同時使用一組長通濾波器在單個檢測窗口中收集熒光發射。這種多路復用策略不僅有利于速度，而且保持了一致的分辨率和對比度（圖4）。

圖4. 多熒光團成像策略示意圖: 四種不同的激光匹配四個選定的熒光團的激發光譜與InGaAs探測器同步

為了標記不同的生物結構，作者采用了不同的注射策略，并利用了熒光團的不同生物分布的性質。循環中的ICG分子被肝臟中的肝細胞迅速吸收，并通過膽道排泄到腸道。根據注射后的時間，肝臟和腸道可以以高的信背比（signal-to-background ratio）可視化。為了使腸道可視化，小鼠在ICG靜脈注射后5-6小時成像。巨噬細胞豐富的器官，如肝臟、淋巴結和骨骼，在JuloChrom5膠束靜脈注射24小時后信號豐富；使用這種策略來提供骨/解剖對比。成像前30-90分鐘腹腔注射JuloFlav7膠束，與ICG標記的腸道一起提供腹腔內的補充信息。最后，為了標記血管系統，成像前15-30分鐘靜脈注射長循環Chrom7膠束。使用相同的實驗方法，作者對兩個籠內社會互動的小鼠進行了成像(圖5)。在本次實驗中，作者選擇1150 nm的長通濾光片，減少了總收集光，因此將曝光時間增加到7.8 ms。最終4通道視頻的有效幀率是30fps保證速度，但當鼠標表現出特別快速的運動時，對較小結構的解析能力有所降低。最后，為了最小化熒光團串擾并避免需要后處理工具來區分不同通道，作者通過降低造影劑濃度，同時以波長相關的方式增加入射激光功率密度。從而獲得了可區分的成像通道，盡管在單個通道中存在一些熒光團串擾。

圖5. 成像室內小鼠進行社交互動時的腹側成像

5. 從行為自由的老鼠身上追蹤器官

為了確定每個器官的位置，從帶有標記器官的視頻中提取生理相關數據。作者選擇使用用于姿態估計的鼠標跟蹤算法來跟蹤小鼠器官，利用深度學習方法DeepLabCut用于預測自由移動的老鼠體內器官的位置。首先在數據集的小部分(通常是每次實驗幀的10%)上定義感興趣器官周圍的手動ROI選擇(標記)。這些標記不僅放置在目標結構上，還放置在外周結構上，以使整個小鼠(背側或腹側)能夠對齊。然后DeepLabCut使用這個初始選擇來訓練自己的卷積神經網絡，最后使用訓練好的模型來預測剩余幀上每個區域的位置，同時作者為了將來的數據提取，在處理管道中將目標結構的每個標記都被轉換到視場的中心，外圍標記圍繞中心標記旋轉，以便鼠標的姿態在不同的幀中對齊。最后，可以在結果對齊圖像堆棧的目標結構上繪制ROIs，最終用于從跟蹤器官中提取定量信息。
 

6. SWIR熒光成像在神經科學研究中的應用面臨的挑戰和前景

盡管本篇文章提出的宏觀SWIR熒光成像管道與神經科學應用似乎相去甚遠，但值得注意的是，SWIR成像已被用于透過皮膚和顱骨的可視化麻醉小鼠的小腦血管或血腦屏障滲漏研究，無創宏觀SWIR成像顯示其他器官(如腸道和肝臟)的能力也表明，非侵入性腦動力學成像在自由行為小鼠的直接或間接腦成像中有著合理前景，有諸多潛在應用。

參考文獻

Arús, B. A.; Cosco, E. D.; Yiu, J.; Balba, I.; Bischof, T. S.; Sletten, E. M.; Bruns, O. T., Shortwave infrared fluorescence imaging of peripheral organs in awake and freely moving mice. Frontiers in Neuroscience 2023, 17.

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