PCR反應出現假陽性結果解析及解決方法
出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
1、引物設計不合適：
選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。
2、靶序列或擴增產物的交叉污染：
這種污染有兩種原因：
一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。
二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
3、出現非特異性擴增帶：
PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：
一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。
二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。
4、出現片狀拖帶或涂抹帶：
PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：
1）、減少酶量，或調換另一來源的酶。
2）、減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環次數。
1、引物設計不合適：
選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。
2、靶序列或擴增產物的交叉污染：
這種污染有兩種原因：
一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。
二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
3、出現非特異性擴增帶：
PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：
一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。
二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。
4、出現片狀拖帶或涂抹帶：
PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：
1）、減少酶量，或調換另一來源的酶。
2）、減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環次數。
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com