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ELISA測定中溫育操作注意事項

瀏覽次數:295 發布日期:2023-5-24  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關鍵的一個因素。ELISA作為一種固相免疫測定,抗原抗體的結合反應在固相上進行,要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結合,必須在一定的溫度條件下反應一定的時間。溫育所需時間與溫度成反比,即溫度越高,則所需時間相對較短。最為常用的溫育溫度有37和室溫,其次是4328

溫育這一步是臨床ELISA測定中最容易出現問題的步驟。通常目前國內ELISA商品試劑盒的反應溫育時間為37 30分鐘~1小時,進口ELISA試劑盒則通常為37 12小時才能有較完全的結合,低于1小時,可能會影響測定下限。因此,關于溫育,在實際測定操作中一定要注意以下幾點:
1、要保證在設定的溫度下有足夠的反應時間。
一般來說,加完樣本和
/或反應試劑后,將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時,孔內溫度從室溫升至37,需要一定的時間,尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態下,這段升溫時間可能還比較長,而在臨床實驗室中,很少有人注意這個問題,通常是將微孔板一放入溫箱即開始計時,這樣就很容易造成實際測定中溫育時間不夠,弱陽性樣本測不出來的問題。曾有一地處南方的血站同行提出了一個問題,就是在每一年的冬季總有那么一個多月的時間,在做HBsAg測定的室內質控中,測定由衛生部臨床檢驗中心供應的1 ng/ml弱陽性樣本時,總是測不出來,不知原因為何?這可能就與南方冬天室內溫度較低有關,此時微孔板轉入溫箱后37溫育時間不夠,以致弱陽性樣本測定為陰性。因此,為保證37下足夠的溫育時間,臨床實驗室可自行確定本實驗室不同季節(不同室溫下)微孔板從室溫拿至溫箱后需要多長時間孔內溫度才能達到37,從而適當延長板條在溫箱中的放置時間。具體的做法是,用一小溫度計放置板孔反應溶液中測量觀察即可。 
2、溫育溫度的選擇。
在有的
ELISA試劑盒的說明書中,指出溫育溫度可有兩種,例如,一種是371小時,另一種則為4345分鐘。從免疫測定的抗原抗體反應的本質來看,在較低的溫度下反應較長的時間最為完全。如28下反應24小時。較高的反應溫度,由于分子運動的加憐惜,反應時間縮短,這一點對分子含量較多的強陽性樣本的測定沒有問題,但對分子含量少的弱陽性樣本則有漏檢的可能。因此,我們建議在臨床ELISA測定中盡量使用較低溫育溫度較長反應時間的條件。
3、“邊緣效應的排除。
以前在使用
96孔板的ELISA測定中,常發現有邊緣效應,即外周孔顯色較中心孔深,產生這種邊緣效應的原因可能為96孔板周孔與中心孔表面或熱力學特征的不同。但有研究證實在溫育中的熱力學梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導體,在實驗室的常規ELISA測定中,將板從室溫(通常在25左右)置于37溫箱,板也升溫時,在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學梯度。因此使用水浴或在將反應溶液加入至板孔中時,將板和溶液均加熱至溫育溫度(如37),就可以很容易地排除邊緣效應,并且可提高測定的重復性。
  總而言之,在臨床ELISA測定中,要保證好的測定效果,可采用下述簡單辦法來確保溫育條件,即盡量采用水浴,溫育中讓微孔板浮于水面上,或將浸透水的沙布放入一大飯盒中成一濕盒,放于溫箱中,這樣就會因為板條孔底部直接與37水或濕布的接觸,以及水浴箱或濕盒內的高溫度,而使反應溶液的溫度迅速與溫室平衡。
 
發布者:上海邦景實業有限公司銷售部
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