Q1：我該如何得到完美的多色結果呢？

A1：首先，您需要有質量不錯的樣本和抗體，這就已經是成功的一半（樣本、抗體選擇攻略），對于樣本來說，脫片是我們需要預防的“頭號公敵”，多色實驗需要重復熱修復洗脫抗體多次，假如片子脫片，輕則成像模糊，重則組織脫落前功盡棄，可以在開始實驗之前先模擬幾輪熱修復，不加抗體和其他試劑，看看組織是否有脫落的跡象，如果脫落比較嚴重，則需要重新制備切片，如果有輕微脫片，則可以考慮購買抗體洗脫液，替代熱修復的過程；然后，就可以開始做實驗了，我們建議您先進行抗體和染料工作條件摸索，再上多染（參考下圖流程），這樣多染的成功率可以達到90%以上哦！（小愛經驗之談，即便是染了千百遍的常見指標，換個樣本，染色效果就可能天差地別，有條件還是建議要做預實驗。）
 

最后的10%，就需要調整指標與染料搭配以及染色的順序了。

Q2：有沒有推薦的染料搭配和染色順序呢？
 

A2：染料搭配一般遵循“寡靶配強光，眾靶配弱光”的原則，意思是表達比較弱的指標搭配熒光信號比較強的染料，表達相對強的指標搭配信號比較弱的染料，Absin的TSA染料波長越短熒光強度越強，比如說需要染PD-1，CD8和CD3，我們手里有一個四色試劑盒（TSA520/TSA570/TSA650），通過IHC發現樣本中PD-1的信號很少，CD3信號非常多，其次是CD8，于是選擇TSA520搭配PD-1，TSA650搭配CD3，TSA570搭配CD8，比較合理。
 

接下來就是怎么安排染色先后順序：

1）劃分細胞定位，先外后內：確定每個指標的細胞定位，膜表達先染，胞漿或者胞核的后染（如果是指標比較多的情況下，胞內指標排在比較后面，經過前期多輪洗脫，可以不做細胞通透；如果指標很少，染胞內指標之前還是需要打孔，多個胞內指標也只需要打一次孔）；
2）確定抗原修復方式，先酸后堿：堿修復比酸修復的力度會更強，個別抗體在用堿修復以后會染出來很多非特異性，所以如果是相同的細胞定位，就先染酸修復，再染堿修復的抗體；
3）根據IHC結果判別，先弱后強：組化結果顯示指標比較少，比較弱的，排在前面染，理論上來說越靠前染的指標效果會越接近單標染色。
 

以上就是一些通用規則，但不同的指標還是可能出現變化，要想得到最完美的結果，就需要不同的排列組合一個一個嘗試（如下表，“X”代表有信號），這樣會比較耗費時間和試劑，您可以根據通用規則先行一次多染，然后各通道跟熒光單染做對比，如果效果差別很大，那就再調整染色順序，如果單染的結果跟組化差別比較大（出現高背景，非特異性明顯），就要考慮更換染料搭配。
 

Q3：我成像完了以后想要做數據分析，你們有什么軟件推薦嗎？
 

A3：目前市面上數據分析軟件還是比較多的，像免費的您可以下載imageJ、Qupath，缺點就是用法都需要您自行摸索；我們公司安裝的是HALO和StrataQuest兩款軟件，HALO是付費的，StrataQuest是我們TG的掃描儀平臺自帶的，從功能、分析的精準度和可操作性來說，肯定是大大優于開源軟件的，且有軟件專業的技術支持團隊能夠答疑解惑。您可以根據您的實際情況選擇合適的分析軟件，如果您實在無從下手，也可以找Absin，我們可以提供數據分析的服務~