到His標簽，大家一定都不陌生。His標簽是一個只有6個組氨酸的小標簽，但神通廣大。首先，His標簽比較小，對蛋白結構和功能影響較小，一般純化后也可以無需切除；其次，His標簽可以和其他標簽一起使用，增加純化的純度；此外，His標簽也可以在變性條件下進行蛋白純化，適用于特殊的操作或者包涵體純化；最后，His標簽蛋白的純化方式多樣，純化工藝也非常成熟，可以選擇重力操作和離心操作，也可以選擇AKTA純化系統。
 

His標簽如此好用，各位是不是也躍躍欲試了呢？今天小優給大家整理了我們使用頻率很高的重力純化以及儀器純化的操作流程，一起來看看吧！

 

重力純化：以cytiva品牌Ni Sepharose 6FF 填料（17531806）為例

 

1.緩沖液配制

按照以下配方進行緩沖液配置：

①結合緩沖液：20mM磷酸鈉緩沖液，0.5M氯化鈉，20-40mM咪唑，PH7.4

②洗脫緩沖液：20mM磷酸鈉緩沖液，0.5M氯化鈉，500mM咪唑，PH7.4

緩沖液配置完成后需要預先過濾和超聲去除氣泡。

 

2.樣品準備

樣品應完全溶解。為了避免色譜柱堵塞，建議離心并通過0.45 μm過濾器過濾，以去除細胞碎片或其他顆粒物質。如果樣品溶解在20mM磷酸鹽緩沖液(0.5 M NaCl，pH 7.4)以外的緩沖液中，將其NaCl濃度調整為0.5 M, pH為7-8

 

3.純化前準備

①PD-10重力空柱（17043501）準備。用20%的乙醇洗滌濾膜，用蒸餾水潤洗濾膜，然后將濾膜放入PD-10空柱；

②填料準備。將需要量的填料懸濁液從瓶中轉移到離心管中，用500xg離心5min以沉淀填料。除去上清，加入適量蒸餾水，輕柔的振蕩填料懸濁液3min，用500xg離心 5min。除去上清，加入適量結合緩沖液進行平衡，輕柔的振蕩填料懸濁液3min，用500xg離心 5min。然后把填料懸濁液轉移到量筒中，再加入適量體積的結合緩沖液，使懸濁液中的填料濃度達到50%。

 

4.重力柱純化

①將樣品加入含有50%填料的懸濁液中（樣品在上柱前要進行離心和過濾）。Ni Sepharose 6FF的平均載量是40mg/ml。則1ml的50%懸濁液的載量為大約20mg蛋白。

②將樣品和填料混合物在搖床上低速混合1h。

③將樣品和填料混合物加入到PD-10的空柱中，收集流出物。

④用結合緩沖液洗滌2-5個柱體積，收集流出物。

⑤用4個柱體積的洗脫緩沖液洗脫，收集流出物。

 

5.檢測

對流出物進行檢測分析，跑膠鑒定

 

儀器純化：以cytiva品牌HisTrap FF 預裝柱（17531901）為例

 

1.緩沖液配制

按照以下配方進行緩沖液配置，

①結合緩沖液：20mM磷酸鈉緩沖液，0.5M氯化鈉，20-40mM咪唑，PH7.4

②洗脫緩沖液：20mM磷酸鈉緩沖液，0.5M氯化鈉，500mM咪唑，PH7.4

緩沖液配置完成后需要預先過濾和超聲去除氣泡。

 

2.樣品準備

樣品應完全溶解。為了避免色譜柱堵塞，建議離心并通過0.45 μm過濾器過濾，以去除細胞碎片或其他顆粒物質。如果樣品溶解在20mM磷酸鹽緩沖液(0.5 M NaCl，pH 7.4)以外的緩沖液中，將其NaCl濃度調整為0.5 M, pH為7-8

 

3.系統準備與裝柱

①系統設置一個低流速，移除預裝柱頂部的堵頭，把柱子連接到ӒKTA純化儀的接頭上，注意要液滴對液滴進行連接，防止引入氣泡。

②去除柱子底部的堵頭，連接到純化儀上。

③用3-5個柱體積的蒸餾水洗去乙醇。

④用5個柱體積的結合緩沖液平衡柱子，建議流速是1ml/min（1ml 體積柱子）。

 

4.上樣

用上樣環或者 superloop 加入預處理的樣品（樣品在上柱前一定要進行離心和過濾），在上樣時建議流速為 0.2-1ml/min（1ml 體積柱子）。

 

5.洗雜

用結合緩沖液洗滌至少10-15個柱體積，直到吸收峰達到穩定基線或在流出物中沒有物質流出。洗滌過程中建議保持流速為1-2ml/min（1ml 體積柱子）。

 

6.洗脫

用洗脫緩沖液采用一步洗脫或者線性梯度洗脫（拉咪唑濃度梯度）。一步洗脫通常5個柱體積，線性洗脫通常10-20個柱體積。在洗脫過程中保持流速為1-2ml/min（1ml體積柱子）。

 

7.清洗與保存

洗脫后，用3-5個柱體積的結合緩沖液洗滌柱子，然后加入20%乙醇。擰上柱子上下的堵頭，防止柱子變干。
 

重力法的操作簡便，易于控制層析柱液體的流動，而且也容易確定目的樣品收集的起點與終點；但由于液體的流動是重力驅動的，過柱速度較慢，一次純化實驗可能耗費較長的時間。而使用純化儀器+預裝柱的方法，則可以更加輕松準確的進行實驗。HiTrap型預裝柱除了可以連接在層析系統中使用，也可以連接注射器手動操作，或者連接在恒流泵（蠕動泵）上運行。
 

總的來說，His標簽蛋白純化主要包括前期樣品、相關試劑和耗材的準備，在純化這一塊，都是標準的平衡-上樣-清洗-洗脫-再生-保存的流程。
 

 

在蛋白純化領域，我們也可以給大家提供很多的精品資源。例如標簽蛋白純化解決方案為大家詳細介紹原核細胞標簽蛋白純化從質粒構建到蛋白表達到蛋白純化每個過程的詳細步驟以及操作技巧，有需要的同學戳鏈接自取哦！
 

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