間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（MSC）近年來被廣泛應(yīng)用在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，可促進(jìn)各種結(jié)締組織的再生。大量證據(jù)表明，移植的MSC通過分泌生長因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞外囊泡來廣泛促進(jìn)組織再生。與單個(gè)分散細(xì)胞相比，MSC在聚集成球狀體后可分泌更高濃度的因子，從而進(jìn)一步提高了組織的再生潛能。

然而，盡管MSC球狀體擁有良好的治療前景，但它們在體內(nèi)的存活率卻很低，且由于降解和擴(kuò)散，這些生物活性因子只能短暫存在于特定的傷口部位。為了解決這個(gè)問題，加州大學(xué)戴維斯分校（UC Davis）的研究人員合成了一種硫酸化海藻酸鹽水凝膠平臺，希望通過封住MSC球狀體分泌的因子來增強(qiáng)組織再生。

該研究發(fā)現(xiàn)，MSC球狀體與硫酸化海藻酸鹽的結(jié)合使用可促進(jìn)肌肉再生。這項(xiàng)研究成果于2023年1月1日發(fā)表在《Acta Biomaterialia》雜志上，有望應(yīng)用于肌肉損傷的修復(fù)。
 

研究材料與方法

在這項(xiàng)研究中，SD大鼠骨髓來源的MSC購自賽業(yè)OriCell^®，研究人員在細(xì)胞傳代后將其培養(yǎng)成MSC球狀體，并轉(zhuǎn)移到海藻酸鹽溶液中，交聯(lián)形成水凝膠。他們在研究中使用了SD大鼠的比目魚肌擠壓傷模型。他們使用偏振光顯微鏡分析了膠原蛋白質(zhì)量和組成，并采用羥脯氨酸含量分析來測定膠原蛋白溶解度。

技術(shù)路線

1.構(gòu)建包含MSC球狀體的硫酸化海藻酸鹽水凝膠

2.評估硫酸化MSC球狀體是否會誘導(dǎo)膠原蛋白沉積

3.評估這種新型水凝膠處理對神經(jīng)支配和血管形成的影響

4.評估肌源性分化標(biāo)志物的表達(dá)，以確定再生肌纖維的成熟度

研究結(jié)果

研究人員發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MSC球狀體被包裹在硫酸化海藻酸鹽水凝膠中時(shí)，生物活性生長因子的保留時(shí)間延長，有助于血管內(nèi)皮形成和成肌細(xì)胞侵襲。于是，他們將這種水凝膠（sulfated）植入大鼠比目魚肌擠壓傷模型中，以評估其治療潛力。對照組包括非硫酸化的水凝膠（non-sulfated）和無細(xì)胞的硫酸化水凝膠（sulfated acellular）。

植入后六周，近紅外成像結(jié)果顯示，硫酸化和非硫酸化水凝膠中的MSC水平相似（圖1），說明硫酸化不影響球狀體的生存能力。與對照組相比，包含MSC球狀體的組表現(xiàn)出更厚且更深色的肌肉。組織H&E成像結(jié)果顯示，水凝膠植入兩周后各個(gè)組中會出現(xiàn)纖維化組織。與非硫酸化組相比，硫酸化組的纖維化組織在六周時(shí)有所減少，表明硫酸化處理導(dǎo)致更有組織的肌肉再生。
 

硫酸化不影響MSC的生存能力^[1]

在肌肉再生過程中，一種常見的失調(diào)是形成纖維化的瘢痕組織，其主要由膠原蛋白組成，會嚴(yán)重限制肌肉的活動能力。于是，研究人員對上述肌肉組織中的總體膠原蛋白水平和不溶性膠原蛋白比例進(jìn)行了量化，以便確認(rèn)纖維化反應(yīng)。結(jié)果顯示，與其他組相比，硫酸化MSC球狀體處理引起的過剩膠原蛋白較少，說明它并沒有誘發(fā)嚴(yán)重的纖維化反應(yīng)。在進(jìn)一步分析膠原蛋白的組成后，研究人員確認(rèn)硫酸化球狀體組誘導(dǎo)的膠原蛋白沉積量較低，膠原蛋白壓實(shí)程度與未受傷的肌肉更相似。

02 包含球狀體的硫酸化水凝膠對肌肉再生的影響
之后，研究人員評估了水凝膠處理對神經(jīng)支配和血管形成的影響。在水凝膠植入六周后，通過對乙酰膽堿受體進(jìn)行染色，經(jīng)硫酸化球狀體處理的損傷顯示出更多的神經(jīng)肌肉接頭。再通過對血管標(biāo)志物CD31的免疫組化染色，他們發(fā)現(xiàn)隨著球狀體的加入，陽性染色呈現(xiàn)增加的趨勢（圖2）。這些數(shù)據(jù)表明，硫酸化球狀體組顯著改善了神經(jīng)肌肉接頭的生成，促進(jìn)了新血管的形成，并在兩周后產(chǎn)生了更多成熟的肌纖維，表明這是一個(gè)有利于神經(jīng)支配和血管形成的環(huán)境。

圖2. 包含球狀體的硫酸化水凝膠促進(jìn)了血管形成和神經(jīng)支配^[1]

研究人員還發(fā)現(xiàn)，六周后再生的肌肉在物理和機(jī)械特性上都與對側(cè)對照肌肉相當(dāng)。硫酸化水凝膠的加入引起肌肉彈性增加，在20%應(yīng)變下的被動動態(tài)應(yīng)力明顯下降。運(yùn)動范圍分析顯示，六周時(shí)的運(yùn)動范圍與對側(cè)對照組相似。這些數(shù)據(jù)表明，在植入水凝膠六周后，損傷組織在被動物理特征方面都接近完全再生。

為了進(jìn)一步分析再生肌纖維的成熟度，研究人員還通過RT-PCR測定了常見的肌源性分化標(biāo)志物的表達(dá)。在損傷后兩周，硫酸化水凝膠中MSC球狀體的處理導(dǎo)致肌肉分化標(biāo)志物Myog的表達(dá)增加。不過在六周時(shí)，各組之間的成熟肌肉形成標(biāo)志物Myh2表達(dá)相似。他們認(rèn)為，硫酸化水凝膠的處理加速了肌纖維的成熟，但由于自然修復(fù)機(jī)制的作用，若評估的時(shí)間點(diǎn)較晚，其效果就會減弱。
 

結(jié)論

研究示意圖^[1]

這項(xiàng)研究采用一系列分析技術(shù)評估了硫酸化海藻酸鹽材料修復(fù)大鼠比目魚肌擠壓傷的能力（圖3）。研究發(fā)現(xiàn)，硫酸化海藻酸鹽與MSC球狀體的組合減少了膠原蛋白沉積，改善了肌源性分化標(biāo)志物表達(dá)，并增加了神經(jīng)肌肉接頭，表明這種方法有望促進(jìn)肌肉再生并減少纖維化。

原文檢索
[1]M.A. Gionet-Gonzales, R.C.H. Gresham, K.H. Griffin et al., Mesenchymal stromal cell spheroids in sulfated alginate enhance muscle regeneration, Acta Biomaterialia, https://doi.org/10.1016/j.actbio.2022.10.054