文章標(biāo)題：Untargeted and targeted metabolomics identify metabolite biomarkers for Salmonella enteritidis in chicken meat

發(fā)表期刊：Food Chemistry

影響因子：9.23

作者單位：揚(yáng)州大學(xué)

百趣提供服務(wù)：發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)Classic-親水版、600MRM

百趣代謝組學(xué)—研究背景

近年來(lái)，食品安全問(wèn)題一直是世界各國(guó)廣泛關(guān)注的問(wèn)題。雞肉由于其高蛋白、低脂肪、低熱量和低膽固醇的特性，已成為全世界消費(fèi)者接受的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來(lái)源。腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)是一種常見的食源性細(xì)菌。

百趣代謝組學(xué)分享，據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上每年感染沙門氏菌的人數(shù)達(dá)到8000萬(wàn)至9400萬(wàn)，其中5.9萬(wàn)至15.5萬(wàn)人死亡。因此，監(jiān)測(cè)和控制雞肉中的沙門氏菌污染對(duì)于保障消費(fèi)者的健康和生命安全至關(guān)重要。

而傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)法、免疫學(xué)法以及PCR檢測(cè)技術(shù)已不能滿足快速高效檢測(cè)現(xiàn)代食源性病原體的要求，本研究結(jié)合非靶向和靶向代謝組學(xué)旨在發(fā)現(xiàn)雞肉中腸炎沙門氏菌污染的代謝生物標(biāo)志物。

百趣代謝組學(xué)—實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）樣本類型：雞肉組織

（2）發(fā)現(xiàn)集（非靶向檢測(cè)）

分組：0h（對(duì)照組，接種沙門氏菌培養(yǎng)0小時(shí)，n=10）；6h（接種沙門氏菌培養(yǎng)6小時(shí)，n=10）；12h（接種沙門氏菌培養(yǎng)12小時(shí)，n=10）；18h（接種沙門氏菌培養(yǎng)18小時(shí)，n=10）。

（3）驗(yàn)證集（靶向檢測(cè)）

污染組（接種沙門氏菌培養(yǎng)18小時(shí)，n=10）和對(duì)照組（新鮮雞肉樣品，n=10）（圖1）。
 

圖1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

百趣代謝組學(xué)—研究結(jié)果
1.雞肉中腸炎沙門氏菌的非靶代謝譜及差異物篩選
通過(guò)非靶向檢測(cè)，正離子模式(POS)和負(fù)離子模式(NEG)分別檢測(cè)出441和240種代謝產(chǎn)物。并使用多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)腸炎沙門氏菌污染不同時(shí)期的代謝物進(jìn)行主成分分析(PCA)，結(jié)果表明，四組在第一個(gè)主成分存在顯著分離，且同組實(shí)驗(yàn)樣本及QC樣本聚集性較好，表明系統(tǒng)的穩(wěn)定性和采集數(shù)據(jù)的可靠性（如圖2E-F）。百趣代謝組學(xué)分享，接下來(lái)作者對(duì)檢測(cè)的代謝物進(jìn)一步進(jìn)行了差異物質(zhì)篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05和FC>1.5。結(jié)果表明，在正離子模式下篩選了238種差異代謝物，其中157種上調(diào)，81種下調(diào)。百趣代謝組學(xué)分享，在負(fù)離子模式下，篩選了174種差異代謝物，其中57種表達(dá)上調(diào)，117種表達(dá)下調(diào)。并通過(guò)火山圖展示了不同比較組的差異代謝物（圖3）。

圖2. 主成分分析（E，正離子模式；F，負(fù)離子模式）

圖3. 火山圖分析（A，正離子模式；B，負(fù)離子模式）

2.潛在代謝產(chǎn)物生物標(biāo)志物的鑒定

接下來(lái)作者對(duì)以上差異物質(zhì)進(jìn)行了OPLS回歸分析，獲得了穩(wěn)健且具有良好預(yù)測(cè)效果的模型（圖4）。并通過(guò)OPLS回歸分析得到的PreVIP值（PreVIP>1.5）進(jìn)一步篩選出30種代謝產(chǎn)物為腸炎沙門氏菌感染的潛在生化標(biāo)志物（圖5AB）。百趣代謝組學(xué)分享，根據(jù)HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的二級(jí)分類將30種代謝產(chǎn)物分為6類，即有機(jī)酸及其衍生物（34.375%）、有機(jī)雜環(huán)化合物（25%）、脂類和類脂分子（21.875%）、無(wú)機(jī)氮化合物（12.5%）、核苷，核苷酸及其類似物（3.125%）和有機(jī)化合物（3.125%）（圖5C）。

圖4. OPLS回歸模型分析（ACE，正離子模式；BDF，負(fù)離子模式）

圖5. 雞肉腸炎沙門氏菌潛在代謝生物標(biāo)志物的鑒定

3. 潛在代謝產(chǎn)物生物標(biāo)志物的代謝途徑分析

作者使用Metalanalyst5.0對(duì)30種潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行了通路富集分析（圖6）。結(jié)果表明，30個(gè)潛在的生物標(biāo)志物共富集到21個(gè)代謝通路途徑，其中6個(gè)通路富集顯著（P<0.05），包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成途徑、脂代謝途徑、組氨酸、泛酸鹽和CoA生物合成途徑、檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）和tRNA生物合成途徑。百趣代謝組學(xué)分享，有研究表明，在肉類中，碳水化合物和某些氨基酸是腐敗相關(guān)代謝產(chǎn)物的前體，另外游離氨基酸可能是細(xì)菌的生長(zhǎng)促進(jìn)劑。因此，富集的代謝途徑對(duì)雞肉腸炎沙門氏菌污染和惡化至關(guān)重要。

圖6. 生物標(biāo)志物的代謝途徑富集分析

4.靶向代謝組學(xué)分析（驗(yàn)證集）

為了準(zhǔn)確識(shí)別受腸炎沙門氏菌污染的雞肉和新鮮雞肉之間的代謝生物標(biāo)志物，作者基于非靶向代謝組學(xué)篩選出的候選生物標(biāo)志物，進(jìn)一步對(duì)腸炎沙門氏菌污染的雞肉和新鮮雞肉進(jìn)行了UHPLC-QQQ-MS靶向定量分析。為了反映腸炎沙門氏菌污染的雞肉和新鮮雞肉之間的差異，進(jìn)行了OPLS-DA建模分析，并使用7倍交叉驗(yàn)證驗(yàn)證了模型質(zhì)量。結(jié)果表明腸炎沙門氏菌污染的雞肉和新鮮雞肉間存在較大代謝差異，且OPLS-DA模型是穩(wěn)健的，沒有過(guò)度擬合（圖7）。

另外通過(guò)P＜0.05和VIP＞1篩選出其中5種代謝物作為雞肉中腸炎沙門氏菌污染的生物標(biāo)志物，包括乙酰膽堿、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-纈氨酸和L-正亮氨酸，且這5種代謝物在非靶代謝譜結(jié)果中也是潛在差異物。接著對(duì)這5種代謝物進(jìn)行歐氏距離矩陣分析法對(duì)差異代謝物進(jìn)行聚類，結(jié)果如圖所示，5種代謝物在不同組間聚集明顯（圖7A）。百趣代謝組學(xué)分享，同時(shí)，箱型圖結(jié)果表明，5種代謝物組間顯著差異，且在污染組都呈現(xiàn)顯著的上調(diào)趨勢(shì)（圖8B），作者推測(cè)這5種代謝物可能是檢測(cè)雞肉中腸炎沙門氏菌污染的潛在生物標(biāo)志物。
 

圖7. 靶標(biāo)代謝組學(xué)OPLS-DA分析

圖8. 5種生物標(biāo)志物的層次聚類和箱型圖分析

5.代謝產(chǎn)物生物標(biāo)志物的ROC分析

ROC曲線用于評(píng)估5種代謝產(chǎn)物生物標(biāo)志物的辨別能力。當(dāng)AUC值在0.5-0.7時(shí)，AUC具有較低的準(zhǔn)確性；AUC值在0.7-0.9，AUC具有良好的準(zhǔn)確性；如果AUC值高于0.9，則AUC具有較高的準(zhǔn)確性。百趣代謝組學(xué)分享，結(jié)果如圖所示，5種代謝物單獨(dú)及聯(lián)合的AUC值均高于0.9（圖9），表明這5種生物標(biāo)志物在預(yù)測(cè)雞肉中腸炎沙門氏菌污染方面具有很高的準(zhǔn)確性。
 

圖9. 5種生物標(biāo)志物的ROC曲線分析

百趣代謝組學(xué)—研究結(jié)論

本研究通過(guò)整合非靶向和靶向的代謝組學(xué)分析來(lái)鑒定雞肉中腸炎沙門氏菌污染的代謝生物標(biāo)志物。百趣代謝組學(xué)分享，30種不同的代謝物被鑒定為候選代謝生物標(biāo)志物。通過(guò)基于UHPLC-QQQ-MS的靶標(biāo)代謝組學(xué)，乙酰膽堿、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-纈氨酸和L-正亮氨酸被確認(rèn)為雞肉中腸炎沙門氏菌的代謝生物標(biāo)志物。

在腸炎沙門氏菌污染的雞肉中，5種代謝生物標(biāo)志物的豐度均顯著上調(diào)。總之，本研究的發(fā)現(xiàn)將促進(jìn)快速準(zhǔn)確地檢測(cè)雞肉中腸炎沙門氏菌新方法的發(fā)展。