利用基質(zhì)膠進行ES細胞(胚胎干細胞)培養(yǎng)測評的實驗流程及結果分析
“道生一，一生二，二生三，三生萬物”。這是出自老子《道德經(jīng)》第四十二章的一句話，它道盡了干細胞的玄妙。那什么是“生萬物之道呢”？對于干細胞來說，要做到“生萬物”，合適的誘導分化是關鍵。如21年德國杜賽爾多夫海因里希海涅大學的Jay Gopalakrishnan團隊用醋酸視黃醇誘導的眼睛類器官[1]；維也納奧地利科學院科研團隊誘導的心臟類器官[2]。而在進行誘導分化“轉化萬物”之前，干細胞的“一生二，二生三”也是不可忽視的。如何在“轉化萬物”前擴增制備足夠數(shù)量的干細胞而又不使其經(jīng)受刺激“提前轉化”呢？那當然就是選擇一款性能優(yōu)異、誘導干擾極低的基質(zhì)膠啦！
本周我們對Cat.No.082777/0827775基質(zhì)膠進行了ES細胞培養(yǎng)測評。讓我們一起看看怎么培養(yǎng)ES細胞以及最終效果吧！
一.樣本信息
�；|(zhì)膠
對照組
二.實驗流程
1.培養(yǎng)材料
試劑：ES細胞、MatrigengeL Matrix、10mM ROCK 抑制劑（Y-27632，工作濃度10μM）；DMEM /F12培養(yǎng)基；mTeSR1/E8培養(yǎng)基；Accutase/EDTA解離劑；PBS(D-PBS)；
材料：無菌槍頭；6 孔板；無菌EP管等耗材；可根據(jù)實驗設計自行調(diào)整。
2.培養(yǎng)預備
（1）配置基質(zhì)膠混合液
a、將基質(zhì)膠置冰上在4℃冰箱過夜解凍；
b、4℃預冷無菌離心管、無菌槍頭、DMEM基礎培養(yǎng)基等接觸基質(zhì)膠的耗材或試劑；
c、將Matrigengel（Cat.No.0827775）按1:80 - 1:100的比例稀釋，對于ES細胞培養(yǎng)，建議涂布濃度約為0.013mg/cm²。
例如，將12.5mg/mL的Matrigengel使用冰冷的DMEM/F12，1:100稀釋后，每個6孔板的涂布量為1mL。
（2）制作基質(zhì)膠涂層
a、按照0.013mg/cm²的量加入Matrigengel混合物加入到預冷的6孔板中，并輕輕搖動培養(yǎng)板以確保混合物均勻地分布在培養(yǎng)板上；
b、將6孔板轉移到37℃培養(yǎng)箱中進行過夜孵育（孵育1-2小時后即可使用，但過夜孵育的涂層更有利于細胞培養(yǎng)）；
c、使用前吸棄涂層上面的液體。
3.ES傳代
（1）傳代前準備好基質(zhì)膠涂布的六孔板及含10μM Y-27632抑制劑的培養(yǎng)基；
（2）顯微鏡下觀察ES細胞狀態(tài)，在潔凈工作臺中吸棄舊培養(yǎng)基，用半培養(yǎng)基量的PBS沖洗后加入培養(yǎng)量一半體積的Acuutase（6孔板中加入0.5mL即可）；
（3）轉移到37℃培養(yǎng)箱消化4分鐘，或在顯微鏡下觀察直到大部分細胞脫落；如果細胞仍然附著，輕輕拍打培養(yǎng)板3-5次，或者在培養(yǎng)箱中孵育適當延長消化時間（不超過15分鐘）；
（4）傾斜培養(yǎng)板，將Accutase溶液沿培養(yǎng)層表面轉移兩次，分離結塊并轉移到離心管中；
（5）用DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)層表面，并與管中的細胞溶液合并在一塊；
（6）室溫下300g 離心5分鐘（殘留的Accutase會干擾細胞的附著和下游應用，如果進行轉染，應該盡量去除干凈）；
（7）吸去上清，用含有10μM Y-27632抑制劑的培養(yǎng)基進行重懸；如果需要，可以用細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)并計算細胞鋪板的體積和面積；
（8）將細胞加入涂層板中，輕輕搖動使細胞分布均勻；
（9）將培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
4.結果觀察
（1）培養(yǎng)24h后換液，撤掉含抑制劑的培養(yǎng)基，換為正常培養(yǎng)基；
（2）換液后24h觀察并拍照記錄。
注意：MatrigengeL Matrix> 4℃時會逐漸聚合成膠，請嚴格把控操作溫度，控制操作時間，稀釋后的基質(zhì)膠混合液同樣需要冰上操作；板材可以在孵育一小時后使用，但過夜孵育的涂層可以使細胞產(chǎn)生較好的長期形態(tài)。
三.實驗結果
10×物鏡下視野
4×物鏡下視野
四.結果分析
1.從細胞的克隆形成率以及克隆面積上看，用Brand C基質(zhì)膠培養(yǎng)的ES細胞與用�；|(zhì)膠培養(yǎng)的效果相當。
2.兩款基質(zhì)膠均無細胞分化現(xiàn)象產(chǎn)生。
五.關于�；|(zhì)膠
�；锘|(zhì)膠經(jīng)過嚴格的質(zhì)檢驗證，具備安全性高、濃度多樣性、批次穩(wěn)定性好、低內(nèi)毒素、無污染的特點。在購買�；a(chǎn)品時，根據(jù)用戶個性化的需求對用戶進行最佳產(chǎn)品、貨號的推薦，以便用戶獲得性價比最高、效果最優(yōu)的產(chǎn)品。
進行ES細胞培養(yǎng)時推薦使用干細胞專用金牌基質(zhì)膠，干細胞專用金牌基質(zhì)膠是在低生長因子基質(zhì)膠之上再次進行優(yōu)化并附加多項測試的基質(zhì)膠，去除干擾因子，更適合干細胞的生長以及后續(xù)添加因子和抑制劑的人為誘導分化。
六.參考資料
[1] https://doi.org/10.1016/j.stem.2021.07.010
[2] https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.04.034
