色譜法利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配，以流動相對固定相中的混合物進行洗脫，混合物中不同的物質(zhì)會以不同的速度沿固定相移動，最終達到分離的效果。

根據(jù)分離機理的不同，色譜可分為五種類型：吸附、分布、交換、排阻和親和。色譜分離方法包括吸附色譜、鍵合相色譜、離子交換色譜、親和色譜和尺寸排阻色譜。

色譜的物理化學(xué)原理（Broekaert J et al.,2015）

親和色譜
親和色譜是色譜分離技術(shù)的一個重要分支。它是一種液相色譜方法，利用固定相的結(jié)合特性吸附目標(biāo)產(chǎn)物并實現(xiàn)分離和純化。例如，酶和基質(zhì)（或抑制劑）、抗原和抗體、激素和受體、外源凝集素和核酸堿基對等之間的特異相互作用，等可形成一種具有不溶性載體的相互作用物質(zhì)，均可用作色譜固定相。然后可以從復(fù)雜的混合物中可逆地攔截另一方，以達到純化的目的。親和層析已廣泛應(yīng)用于生物分子的分離和純化，是分離純化結(jié)合蛋白、酶、抑制劑、抗原、抗體、激素、激素受體、糖蛋白、核酸、多糖等生物大分子的重要方法之一。

用于蛋白質(zhì)純化的親和色譜的平衡（1），吸附/洗滌（2）和解吸附（3）步驟的示意圖（Luana et al.,2012）

尺寸排阻色譜
尺寸排阻色譜（SEC）也稱為凝膠色譜，利用分子篩使大小和數(shù)量不同的分子，根據(jù)各組分的排阻能力不同完成組分的分離。小分子量化合物可進入孔中并具有較長的停留時間，而大分子量化合物被阻止進入孔中，繼續(xù)隨流動相流動。當(dāng)洗脫液為水溶液或緩沖液時，稱為凝膠過濾色譜（GFC），在生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛；當(dāng)使用有機溶劑作為洗脫液時，稱為凝膠滲透色譜（GPC），被廣泛用于高分子領(lǐng)域。尺寸排阻色譜通常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)和核酸。

凝膠過濾色譜基于蛋白質(zhì)分子量或分子形狀的差異對樣品進行分離。當(dāng)樣品從色譜柱頂部向下移動時，大的蛋白質(zhì)分子無法進入凝膠顆粒并被快速洗脫；而較小的蛋白質(zhì)分子可以進入凝膠顆粒，并且較小的蛋白質(zhì)進入凝膠的保留時間不同。分子量越大，洗脫時間越早，從而使具有不同分子大小的蛋白質(zhì)被分離。

鍵合相色譜
根據(jù)分離組分在流動相和固定相中的溶解度不同，對樣品進行分離。該方法使用一種特殊的液體物質(zhì)涂覆載體表面，或與載體表面化學(xué)鍵合以形成固定相。涂覆固定（第一種操作方法）現(xiàn)在很少使用，化學(xué)鍵合固定相如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱，在工業(yè)上最常用。根據(jù)固定相和流動相的類型，液相色譜可分為正相色譜（NPC）和反相色譜（RPC）。隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜的應(yīng)用范圍逐漸擴大，現(xiàn)已應(yīng)用于分析一些非極性樣品或易分離的樣品。

吸附色譜
吸附色譜法使用固體吸附劑分離混合物中的組分，常用的吸附劑是硅膠或氧化鋁。該方法基于固定的相對組分吸附力的大小來分離各組分。整個過程取決于吸附-解吸的平衡。這種分離方法適用于分離分子量為200-1000的異構(gòu)體以及非離子化合物。局限性是離子化合物的分離容易拖尾。

參考文獻

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2. Broekaert, J.A.C. Daniel C. Harris. Quantitative chemical analysis, 9th ed. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2015(407): 8943–8944.
3. Luana Cassandra Breitenbach Barroso Coelho, Andréa Santos, Maria T.S. Correia, et al. Protein Purification by Affinity Chromatography, Intech Open, 2012.
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