乳酸是CHO細胞補料分批培養的主要副產品之一。在 pH 控制的生物反應器中， 由于添加堿以控制細胞培養基的 pH值，高水平乳酸的積累伴隨著高滲透壓，可能導致制造細胞生長緩慢，甚至大量凋亡，同時產生抗體蛋白的產量也降低不少。而 乳酸脫氫酶 (LDH) 是一種催化底物丙酮酸轉化為乳酸的酶，包括丙酮酸濃度在內的許多因素都會調節 LDH 活性。
乳酸脫氫酶對代謝產物的影響
     
在一項研究中，科學家們曾嘗試敲低乳酸脫氫酶 A (LDHa) 和 PDHK 的基因表達，以研究對乳酸代謝和蛋白質生產的影響。他們發現，使用攜帶 LDHa 和 PDHK 的小抑制性 RNA (siRNA) 的單個靶向載體，可以成功地同時下調 LDHa 和 PDHK。此外，他們使用 siRNA 介導的 LDHa/PDHKs 敲低克隆的分批補料搖瓶評估數據顯示，在表達治療性單克隆抗體的 CHO細胞中下調 LDHa 和 PDHKs會減少乳酸產量，增加比生產率和體積 抗體產量分別減少約 90%、75% 和 68%，對細胞生長沒有明顯影響。從在生物反應器中進行的評估中也觀察到 siRNA 克隆平均較低乳酸水平和較高抗體生產率的類似趨勢。

降低CHO細胞培養中的乳酸水平的方法
生物制藥蛋白質產品市場正在快速增長，在2010年時已經達到 700 億美元。由于對功能性蛋白質的需求增加，需要開發技術以實現更高的生產率。為實現這一目標，已經在 CHO細胞中探索了包括宿主細胞工程在內的不同方法。CHO 細胞廣泛用于生產治療性蛋白質，包括在具有受控 pH 值的生物反應器中使用分批補料工藝生產重組單克隆抗體。乳酸是補料分批培養過程中積累的主要副產物之一，已表明高乳酸水平會抑制細胞生長和蛋白質生產。

生物反應器中葡萄糖乳酸指標分析一般使用EKF Biosen C-Line 乳酸分析儀來在線測定，培養過程中多數選用通過調節培養基中的堿度的方式來維持適宜細胞生長的PH環境。但是，乳酸分泌和向培養基中增加堿這兩者都會導致滲透壓增加，從而抑制細胞生長并導致抗體生產率降低。因此，降低乳酸水平對于開發穩健且高效的抗體生產過程是可取的。乳酸分泌和向培養基中增加堿以維持 pH 值會導致滲透壓增加，從而抑制細胞生長并導致抗體生產率降低。因此，降低乳酸水平對于開發穩健且高效的抗體生產過程是可取的。乳酸分泌和向培養基中增加堿以維持 pH 值會導致滲透壓增加，從而抑制細胞生長并導致抗體生產率降低。因此，降低乳酸水平對于開發穩健且高效的抗體生產過程是可取的。
     
有許多因素會影響哺乳動物細胞培養物中的乳酸生成，包括丙酮酸的細胞內濃度。丙酮酸是 LDH 和 PDH 的底物，是決定消耗的碳源是通過糖酵解氧化后作為乳酸排出還是在 TCA 循環中進一步代謝的關鍵分支點。LDH 在催化丙酮酸和乳酸轉化的同時也催化 NADH 和 NAD+ 的相互轉化。在哺乳動物細胞中，LDH 以同源或異源四聚體的形式存在，主要由 LDHa 和 LDHb 基因編碼的 A 和 B 亞基組成。在 CHO 細胞中，LDH 同種型已被證明是 A3B 和 A2B2 四聚體的中間體。
 
PDH 復合體活性的調節方法
PDH 復合體是一種多酶單位，由三種催化酶 E1、E2 和 E3 組成。該復合物催化將丙酮酸轉化為乙酰輔酶 A 的限速反應，乙酰輔酶 A 是三羧酸 (TCA) 循環的入口點。PDH 的活性受 PDHK 和丙酮酸脫氫酶磷酸酶 (PDHP) 的調節。PDHK 磷酸化 PDH 以抑制其酶活性，而 PDHP 去磷酸化并因此激活 PDH 酶活性。哺乳動物細胞中有四種 PDHK 同種型：PDHK1、PDHK2、PDHK 3 和 PDHK4。這些同種型中的每一種都具有不同的組織特異性分布。由于 LDHa 和 PDHKs 的表達都可以影響丙酮酸水平，并且之前已經表明敲低 LDHa 表達可以降低乳酸水平，他們假設如果他們同時減少 LDHa 和 PDHKs 的表達CHO 細胞中，更多的丙酮酸可能會轉化為乙酰輔酶 A，從而增加這些細胞中 TCA 循環產生的能量。因此，LDHa 和 PDHK 的下調可能不僅會導致乳酸減少，還會導致 CHO 細胞中抗體產量增加。
       
在這項研究中，他們證明了使用單個 siRNA 靶向載體可以同時降低 LDHa 和 PDHK1、2 和 3 的表達。當他們同時降低 LDHa 和 PDHK1、2 和 3 基因表達，使用EKF  Biosen C-Line 乳酸分析儀進行乳酸分析后，發現不僅乳酸水平大幅降低，抗體產量居然也增加了不少。

構建靶向 LDHa 和 PDHK1、2、 3 的載體
LDHa 的靶向序列是根據 Kim 和 Lee 的論文選擇的，LDHa siRNA 序列是CTCGATTCCGTTATCTGAT。為了設計 PDHK 的 siRNA 靶向序列，CHO PDHK1、2 和 3 的部分 cDNA 序列通過逆轉錄-聚合酶鏈反應 (RT-PCR) 克隆，引物位于 PDHK 的高度保守區域內，部分克隆的序列也用于 siRNA 序列設計。
構建靶向 PDHKs 和 LDHa 的 siRNA 載體在哺乳動物細胞中報道了四種 PDHK 基因 。為了確定是否所有四種 PDHK 基因都在 CHO細胞中表達，基于人和小鼠 PDHK 序列之間的保守區域設計了四組 RT-PCR 引物。 PCR 結果顯示，即使在 CHO 細胞中可以檢測到所有四種 PDHK mRNA，但 PDHK4 mRNA 水平最低，并且遠低于 DHFR 缺陷型 CHO 細胞中的其他 3 種 PDHK（數據未顯示）。
   
實驗已經證明，單獨降低 LDHa 基因表達能夠減少乳酸的產生。然而，盡管乳酸水平降低了 45-79%，但 Qp 和產物滴度沒有明顯改善，這表明在 CHO 細胞中單獨敲低 LDHa 不足以有效提高 Qp 和產物產量。
       
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