基于肺炎兒童尿液外泌體蛋白組的生物標志物研究成果
目前病毒是導致全球范圍內兒童肺炎最主要的病原菌之一，因此能夠快速和準確的診斷病毒性肺炎是早期干預阻止病情進展的重要措施。但是病毒性肺炎和其他諸如細菌、肺炎支原體等引發的肺炎在臨床表型上很難區分，病原菌檢測有一定程度的滯后性，所以尋找可以替代診斷的生物標志物是臨床診斷兒童肺炎的迫切需求。
前期的多項研究表明尿液外泌體可以作為診斷和評估很多疾病的潛在標志物。并且蛋白組學也揭示了尿液外泌體富含很多免疫相關分子1。因此探究尿液外泌體在感染性疾病中的潛在應用具有很大的價值。2023年1月12日，兒科學領域內的權威期刊Pediatric Research在線發表了上海兒童醫學中心聯合華盈生物共同開展的基于肺炎兒童尿液外泌體蛋白組的生物標志物研究成果2。
本項研究分為發現集和驗證集，納入了正常兒童、肺炎支原體肺炎兒童和病毒性肺炎兒童。發現階段利用Exosome Isolation Q3 試劑盒提取尿液外泌體，進行label free蛋白組學。結果鑒定了1621個蛋白（unique peptides >2），結合文獻數據庫，排除與尿液高豐度蛋白THP共富集的蛋白組分以及可溶性蛋白組分后，總共1246個被認為是高可信的尿液外泌體蛋白，其中79%的蛋白可在外泌體蛋白數據庫Exocarta檢索到，典型的外泌體marker: CD9, CD81, TSG101, PDCD6IP (ALIX) 和CD63可在50%-100%的樣本中被鑒定到，這些結果說明了高質量的尿液外泌體提取和蛋白組學數據（圖1）。
圖1 尿液外泌體的蛋白組學
PCA分析揭示了病毒性肺炎兒童的尿液外泌體蛋白組與肺炎支原體肺炎兒童和健康兒童間存在很顯著的差異，特別是響應病毒感染的干擾素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs)編碼的蛋白顯著富集在病毒性肺炎兒童的尿液外泌體中，并且部分病毒受體例如ACE2,ANPEP, DPP4 和 LAMP1在病毒性肺炎兒童的尿液外泌體中的表達高于健康兒童。我們又進一步的對260個與病毒感染相關的顯著差異蛋白進行了功能富集分析，發現了這些差異蛋白參與到病毒感染和肺部感染的相關生物學過程和通路中，例如中性粒細胞活性、內吞、胞外基質、糖基化等代謝通路等（圖2）。這些結果證實了尿液外泌體確實可以反映出宿主響應病原菌感染的分子變化，可以作為感染性疾病診斷的潛在標志物來源。
圖2 尿液外泌體蛋白組學的功能分析
在本研究的初步驗證階段，我們又另外納入了20名健康兒童、12名病毒性肺炎兒童和17名肺炎支原體肺炎兒童，同樣利用Exosome Isolation Q3 試劑盒提取尿液外泌體開展基于多重反應監視（multiple reaction monitoring，MRM）的靶向蛋白組學分析。我們選擇了33個與病毒感染相關的差異性蛋白，結果19個蛋白可被MRM成功檢測到，定量分析發現了其中8個蛋白 (ANPEP, ASAH1, COL11A1, EHD4, HEXB, LGALS3BP, SERPINA1, SERPING1)的13個多肽只在病毒性肺炎兒童中顯著高于健康兒童，說明了這8個蛋白可作為診斷兒童病毒性肺炎的潛在標志物進行后續的臨床驗證（圖3）。
圖3 MRM驗證尿液外泌體蛋白
總結與討論
尿液獲取因為完全無創性，也成為檢測腎臟、膀胱和尿道相關疾病標志物的來源。不僅如此，已有研究表明了尿液外泌體蛋白可以作為診斷多種神經系統疾病潛在標志物3，說明尿液也富含遠端器官組織來源的外泌體，因此基于尿液外泌體開發疾病標志物具有非常大的應用前景。# 關于華盈 #
上海華盈生物醫藥科技有限公司（以下簡稱“華盈生物”）成立于2012年，是外泌體研究服務領域的領導品牌，擁有外泌體研究“一站式服務”體系，覆蓋外泌體研究的方方面面，包括：外泌體的三項鑒定（電鏡、WB、NTA）、外泌體蛋白組篩選（Labelﾠfree、DIA、PRM、MRM）、外泌體核酸篩選（miRNA、全轉錄組）、外泌體納米流式檢測、外泌體細胞&動物功能實驗（PKH26/DiR/量子點、熒光示蹤）等。華盈生物還自主研發了Exosome Isolation Q3 系列外泌體提取試劑盒，可以針對尿液、血清/漿、細胞上清等樣本進行外泌體的分離，得到的外泌體可以進行下游的鑒定分析、RNA測序等。
多年來華盈生物服務客戶已經覆蓋國內各大著名的高校院所和多位院士課題組。華盈的專業和專注也已獲得業界普遍認可，華盈生物外泌體研究合作伙伴的科研成果也先后在AdvﾠSci、JﾠClin Invest、Biomaterials、Cancer Res等著名期刊上發表。
參考文獻
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3. Wang S, Kojima K, Mobley JA, West AB. Proteomic analysis of urinary extracellular vesicles reveal biomarkers for neurologic disease. EBioMedicine. 2019;45:351-361.
