T細胞亞型作為預測免疫治療應答的標志物

在單細胞應用于免疫治療研究的歷史沿革中，早期基于組織免疫組化的研究證實了在anti-PD-1治療的應答黑色素瘤病人的侵襲腫瘤邊緣， 不管是治療前還是治療后相對于無應答者CD8+ T細胞在應答患者中的增殖會顯著增加。相一致的，CD8+ T細胞的效能分子Granzyme B也在應答患者免疫治療后顯著增加[1]。

CD8\Ki67雙色免疫組化

 

|   流式分析

然而組織中檢測并不是一個最優的標志物研究方案，2017年Wherry團隊在Nature發文發現了黑色素瘤病人外周血中與anti-PD-1或者anti-CTLA-4治療顯著相關的T細胞亞型[2]。他們利用高維度的流式細胞術發現了免疫治療后Ki67+ PD-1+ CD8 T細胞顯著增多。但是雖然治療后有大約74%的病人外周血中Ki67+ PD-1+ CD8 T細胞增加，但是僅有38%的病人獲得臨床受益，因此單獨的Ki67+ PD-1+ CD8 T細胞并不能預測免疫治療效果。這也暗示了可能存在更細分的細胞亞群或其他的影響因素與治療效果相關。研究者之后發現了Ki67+ PD-1+ CD8 T細胞與腫瘤負荷（TB）具有顯著的相關性。Ki67的高表達也代表著高的腫瘤負荷，因此Ki67+ PD-1+ CD8 T細胞增多反而預示著預后不良。最終研究者提出了利用Ki67+ PD-1+ CD8 T細胞與腫瘤負荷的比值可以預測對免疫治療的效果，治療后Ki67/TB >1.94的患者具有高的總體生存率。

 

預測anti-PD-1治療

除了T細胞的類型變化，T細胞的效應分子同樣與免疫治療具有相關性，就像上述CD8+ T細胞的效能分子Granzyme B。Krieg等利用質譜流式（CyTOF）和FlowSOM分析了黑色素瘤病人在anti-PD-1治療前后外周血PBMC中的不同類型的細胞變化[3]。他們發現了外周血中總的CD4+ 或CD8+ T細胞的比率在應答患者中顯著下降，但是利用CyTOF分析T細胞的多種功能細胞因子，發現了每個細胞因子在治療前后的變化不盡一致，但是通過因子組合性的分析方法，研究者發現了CD4+ T細胞的3種類型的因子組合在應答患者中顯著增加，CD8+ T細胞有13種類型的因子組合在應答患者中顯著增加。這個研究說明了T細胞的功能性細胞因子也可以作為預測免疫治療是否應答或抵抗。

 

CD8+ T細胞的不同因子組合（CCG）在應答和無應答間的差異

 

|   單細胞測序

流式分析因其有限的marker限制了新類型細胞亞型的發現，而單細胞轉錄組測序（sc-RNA）以無偏的檢測方式結合各種高級的生信分析方法已經成為了腫瘤免疫研究領域最常用的技術手段。Sade-Feldman等人利用sc-RNA測序分析了轉移性黑色素瘤患者在anti-PD1或anti-CTLA4+PD1治療前后組織中的淋巴細胞（CD45+）[4]。聚焦分析CD8+ T細胞，結果鑒別了2種類型的CD8+ T細胞，其中一類高表達TGF7基因的CD8+ T細胞在應答患者中顯著增加，通過免疫熒光驗證了TCF7+CD8+ T細胞與免疫治療應答具有顯著相關性，可以作為預后標志物。同時還發現了表達耗竭型marker TIM3 和CD39的CD8+ T細胞在無應答患者中顯著富集。同時靶向這2個耗竭型marker可以增加anti-PD1的抗腫瘤效果。

 

sc-RNA測序發現預測免疫治療應答的CD8+ T細胞亞型

|   單細胞TCR測序

除了證實CD8+ T細胞亞型可以預測免疫治療應答或抵抗外，另外一個重要的問題是響應免疫治療的T細胞是來源于預先存在的腫瘤侵潤淋巴細胞（TILs）的重新恢復，還是征募的新的T細胞。2019年一項Nature medicine上發表的研究利用sc-RNA測序和sc-TCR測序分析了11個基底細胞癌患者anti-PD1治療前后的TILs[5]。結果發現了耗竭型CD8+ T細胞在治療后最為顯著性的增加，這些耗竭型CD8+ T細胞表達慢性活化、T細胞功能障礙和腫瘤反應性的基因。結合TCR測序發現了克隆擴增最多還是耗竭型CD8+ T細胞。然而對比分析治療前和治療后的T細胞克隆發現了治療后絕大部分擴增的克隆在治療前并不存在，說明了這些擴增的克隆是在治療后新形成的。研究者最后還揭示了治療后大約40%的TILs克隆可以在外周血中檢測到，并且顯著增加的也是耗竭型CD8+ T細胞。說明了組織中新的T細胞克隆很可能是來源于外周血。之后2020年Nature上的一項研究證實了免疫治療后腫瘤組織和癌旁組織中存在共同克隆擴增的T細胞，并且在外周血中也同樣存在[6]。

 

免疫治療后耗竭型CD8+ T細胞具有最大的克隆擴增，并且是由新的克隆替代

 

那么這些外周血中克隆擴增的CD8+ T細胞是否也與免疫治療預后具有顯著相關性呢。Fairfax等人對55個黑色素瘤病人在anti-PD1或anti-PD1+CTLA4聯合治療前后的血液CD8+ T細胞進行了常規的轉錄組學分析，證實了很多編碼TCR的基因在應答組中的表達顯著高于無應答者[7]。并且在應答患者中存在更多的大的CD8+ T細胞克隆，大的CD8+ T細胞克隆越多的患者在治療后的生存率越高。說明了外周血中克隆擴增的CD8+ T細胞可以作為免疫治療的效果的預測標志物。

外周血中克隆擴增的CD8+ T細胞可以預測免疫治療應答的標志物
 

就像上述的一些研究所述CD8+ T細胞的功能效應因子也與免疫治療的效果具有顯著相關性。功能障礙的CD8+ T細胞主要就是因為不能夠產生效應因子（例如IFN-γ，TNF）和細胞毒分子（例如granzymes 和perforin），從而失去了殺死腫瘤細胞的能力。能夠對免疫治療后響應，說明了CD8+ T細胞分泌功能性因子的能力增加。因此，這些功能性細胞因子的分泌結合T細胞的變化或許可以更好的預測免疫治療應答或抵抗。上述有項研究利用質譜流式檢測了細胞因子，但是質譜流式檢測的畢竟不是活細胞而且不是真正分泌出的細胞因子含量，所以需要更合適的技術檢測單細胞的功能性蛋白（細胞因子）。很多研究通過sc-RNA測序結果中這些效應細胞因子的表達推測CD8+ T細胞的功能狀態，但是轉錄水平的改變忽視了蛋白修飾和再加工的過程，已經有研究報告了耗竭型CD8+ T細胞有高表達mRNA但是幾乎不表達蛋白或者細胞毒作用，所以必須謹慎的利用T細胞轉錄組數據推測其功能狀態。如何突破單細胞功能蛋白組的瓶頸，實現真正意義上單細胞層面分泌蛋白組（細胞因子）的檢測？去年Nat Rev Clin Oncol發表的一篇綜述上提到了一項新的技術IsoPlexis單細胞功能蛋白組學[8]，可以同時檢測500-1500個活的單細胞分泌的32種細胞因子，對關鍵細胞亞型進行功能表征。

 

|   IsoPlexis單細胞功能蛋白組

2020年發表在J Clin Oncol雜志上的一項研究就利用單細胞功能蛋白組學發現了CD8+ T細胞的多功能性可以作為NKTR-214（bempegaldesleukin）與Opdivo（nivolumab）免疫組合療法的療效預測標志物[9]。研究者分析了血液CD8+和CD4+ T細胞、NK細胞，只有多功能性CD8+ T細胞（分泌≥2個因子）的比例在客觀緩解的患者一組中顯著升高，在無應答的患者中并沒有變化。這也與免疫檢查點抑制主要影響CD8+ T細胞的結論相一致。在之后為期3年的研究中，研究者發現了CD8+ T細胞的多功能指數PSI（多功能性細胞比例x檢測因子的信號強度）差異高的患者表現出更高的客觀緩解率。這些結果說明了通過Isoplexis單細胞蛋白組分析得到的CD8+ T細胞多功能性指數PSI可成為與患者應答相關的預測性標志物。
 

CD8+ T細胞PSI差異大的的患者免疫治療后的客觀緩解率高

外周血中CD8+ T細胞多功能指數PSI或許和T細胞的克隆擴增直接相關。Axelrod等人利用IsoPlexis分析了4個乳腺癌病人在新輔助化療前后外周血中的PD1+和PD1-的CD4、CD8 T細胞[10]。結果發現在治療后PD1+ CD8 T細胞的多功能性顯著增加，通過對CD8 T細胞進行TCR測序分析發現治療后克隆擴增最多的也是PD1+ CD8 T細胞，而不是PD1- CD8 T細胞。這就說明了IsoPlexis分析得到T細胞多功能性指數與克隆擴增具有直接相關性，是否可以反應克隆擴增的程度可能需要更多的研究數據來驗證。

新輔助化療前后PD1+ CD8 T細胞克隆和多功能性的變化
 

雖然免疫治療主要發揮效應的是CD8+ T細胞，但是有研究已經發現了CD4+ T也可以支持免疫治療反應。Abbas等人利用IsoPlexis分析了16名急性髓樣淋巴瘤患者在anti-PD1治療前后骨髓中的CD8+和CD4+ T細胞[11]。發現了應答患者中只有CD4+ T細胞的多功能指數PSI顯著增加，與總生存率具有顯著相關性。每個因子的貢獻度分析揭示了IFN-γ和TNF-α是驅動CD4+ T細胞的多功能性增加的主要驅動因子。聚類分析也揭示效應性因子在應答患者CD4+ T細胞分泌的因子中占主導。

 

CD4+ T細胞的多功能性發生了改變
 

近期J Immunother Cancer雜質發表的一項臨床2期試驗中，同樣利用IsoPlexis分析發現了血液中CD4+ T細胞的多功能性與免疫治療具有顯著相關性[12]。這項試驗是臨床轉化標志物的研究，目的是為了預測anti-CTLA4或者聯合anti-PD1治療晚期黑色素瘤病人的應答。首先是通過CyTOF發現了應答患者中CD4+ T細胞在治療后顯著增加，并且主要是中央記憶性T細胞的增加，不是調節性T細胞。之后IsoPlexis進行功能表征分析，一致的，CD4+ T細胞的PSI在治療后顯著增加，并且主要是效應性因子的增加，調節性因子反而在應答患者中是下降的，這也與CyTOF的結果相一致。

 

CyTOF和IsoPlexis聯合分析發現CD4+ T細胞多功能性在免疫治療后顯著增加

 

對于靶向免疫抑制檢查點治療抵抗的病人，可以采用TIL的過繼細胞療法。Nature medicine上發表了一項臨床1期試驗，評估了TIL 過繼細胞療法處理anti-PD1治療后疾病還進展的病人[13]。活性評估發現了69%（11/16）的病人發生了腫瘤消退。為了評估TIL 過繼細胞療法對體內T細胞功能的影響，研究者利用IsoPlexis分析了其中12名患者用藥進程不同階段血液中CD8+和CD4+ T細胞的多功能性。結果發現了TIL 過繼細胞療法主要是增加CD8+ T細胞的多功能性。同樣的，流式細胞術分析也展示了TIL 過繼細胞療法主要增加的是效應性CD8+ T細胞。這說明了IsoPlexis分析得到的多功能性指數PSI與細胞表型相一致。

 

TIL 過繼細胞療法主要持續增加CD8+ T細胞的多功能性

 

在評估免疫細胞與腫瘤免疫治療間的相關性上，研究的趨勢已經從僅僅的細胞表型特征關聯向細胞功能特征關聯發展。IsoPlexis單細胞功能蛋白組學可以同時實現對500-1500單個細胞分泌的32種功能蛋白的檢測，其提供的蛋白質組學功能層面的數據，與臨床結果具有顯著相關性。特別是在腫瘤免疫領域，對T細胞功能表征研究具有革命性的改變。

 

 

|   相關文獻

1. Tumeh PC, Harview CL, Yearley JH, Shintaku IP, Taylor EJ, Robert L. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 2014;515(7528):568-71.

2. Huang AC, Postow MA, Orlowski RJ, Mick R, Bengsch B, Manne S. T-cell invigoration to tumour burden ratio associated with anti-PD-1 response. Nature. 2017;545(7652):60-65.

3. Krieg C, Nowicka M, Guglietta S, Schindler S, Hartmann FJ, Weber LM et al. High-dimensional single-cell analysis predicts response to anti-PD-1 immunotherapy. Nat Med. 2018;24(2):144-153.

4. Sade-Feldman M, Yizhak K, Bjorgaard SL, Ray JP, de Boer CG, Jenkins RW et al. Defining T Cell States Associated with Response to Checkpoint Immunotherapy in Melanoma. Cell. 2018;175(4):998-1013.e20.

5. Yost KE, Satpathy AT, Wells DK, Qi Y, Wang C, Kageyama R et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 2019;25(8):1251-1259.

6. Wu TD, Madireddi S, de Almeida PE, Banchereau R, Chen YJ, Chitre AS. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 2020;579(7798):274-278.

7. Fairfax BP, Taylor CA, Watson RA, Nassiri I, Danielli S, Fang H et al. Peripheral CD8 + T cell characteristics associated with durable responses to immune checkpoint blockade in patients with metastatic melanoma. Nat Med. 2020;26(2):193-199.

8. Gohil SH, Iorgulescu JB, Braun DA, Keskin DB, Livak KJ. Applying high-dimensional single-cell technologies to the analysis of cancer immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 2021;18(4):244-256.

9. Diab A, Tykodi SS, Daniels GA, Maio M, Curti BD, Lewis KD. Bempegaldesleukin Plus Nivolumab in First-Line Metastatic Melanoma et al. J Clin Oncol. 2021;39(26):2914-2925.

10. Axelrod ML, Nixon MJ, Gonzalez-Ericsson PI, Bergman RE, Pilkinton MA, McDonnell WJ et al. Changes in Peripheral and Local Tumor Immunity after Neoadjuvant Chemotherapy Reshape Clinical Outcomes in Patients with Breast Cancer. Clin Cancer Res. 2020;26(21):5668-5681.

11. Abbas HA, Sun H, Pierce SR, Kanagal-Shamanna R, Li Z, Yilmaz M et al. Single-cell polyfunctional proteomics of CD4 cells from patients with AML predicts responses to anti-PD-1-based therapy. Blood Adv. 2022 Apr:bloodadvances.2022007172.

12. Friedman CF, Spencer C, Cabanski CR, Panageas KS, Wells DK, Ribas Aet al. Ipilimumab alone or in combination with nivolumab in patients with advanced melanoma who have progressed or relapsed on PD-1 blockade: clinical outcomes and translational biomarker analyses. J Immunother Cancer. 2022;10(1):e003853.

13. Creelan BC, Wang C, Teer JK, Toloza EM, Yao J, Kim S et al. Tumor-infiltrating lymphocyte treatment for anti-PD-1-resistant metastatic lung cancer: a phase 1 trial. Nat Med. 2021;27(8):1410-1418.