各位老師好，本期為大家帶來單細胞轉錄組標準分析之降維聚類。

單細胞研究的重點就是對細胞進行分群和鑒定，然而單細胞測序數據是一個高維的復雜數據陣列，通常涉及到龐大的細胞數量，以及每個細胞中的眾多基因。因此，面對復雜的數據陣列，在聚類之前，一般采用 PCA 方法進行適度降維以降低計算量和噪音，然后用 Leiden 方法尋找降維空間中鄰近細胞網絡的模塊。最后，采用 tSNE 和 UMAP 兩種非線性降維方法分別對單細胞群聚類結果作可視化分析展示。

Q：如何進行數據降維？
降維的過程其實就是去繁存簡，每個基因對細胞來講都是一個變化維度。數據特征維度太高，不但計算很麻煩，其次特征之間可能存在相關的情況 ，從而增加了問題的復雜程度，分析起來也不方便，所以需要盡可能保證真實差異的前提下減少維度的數量，PCA就是合理的方式之一，既可以減少需要分析的特征，也盡可能多的保留原來的數據信息。
 
步驟一：尋找高變基因
降維的過程依賴于基因表達量，因此挑選那些更能代表整體差異的基因進行降維分析是非常關鍵的，一般來說如果一個基因在細胞群體中變化幅度很大，它就是受關注對象，我們會認為是生物因素導致了這么大的差異，該基因即為高度變化基因（highly variable genes ，HVGs）。
Seurat包FindVariableFeatures函數，會計算一個mean-variance結果，根據基因表達量方差和均值篩選，以此獲得高度可變的基因，一般默認采用前2000個高變基因進行后續降維分析。
 

高變基因示例圖
 

步驟二：降維
主成分分析 (PCA, principal component analysis)PCA的本質是將n個特征減少到k個，保留那些對生物差異貢獻很大的特征。通過數據壓縮，減少后面分析會使用到的維度，減少分析難度的同時盡可能的保留原有數據的特征。
 
步驟三：選擇合適的PCs
利用Elbow Point進行選擇。Elbow Point作圖后，一般選擇斜率平滑的點之前的所有PC軸，加起來差異累計過90%就可以接受，根據后面聚類的結果可以重復調整。每個PCs都能捕獲一些生物差異，而且前面的PC比后面的PC包含的差異信息更多，更有價值 。

細胞聚類目的是根據細胞中各個基因表達模式的相似性（或距離）將一組細胞劃分成具有生物學意義的亞群。Leiden算法是一種適用于scRNA-Seq數據集進行細胞聚類的算法。
 

Leiden聚類算法原理圖

Leiden算法從單例分區（a）開始。該算法將單個節點從一個社區移動到另一個社區，以找到合適的分區（b），然后對其進行細化（c）�；�于細化分區創建聚合網絡（d），使用非細化分區為聚合網絡創建初始分區。例如，（b）中的紅色社區被細化為（c）中的兩個子社區，在聚合之后，它們成為（d）中兩個獨立的節點，都屬于同一社區。然后，算法移動聚合網絡（e）中的各個節點。在這種情況下，細化不會改變分區（f）。重復這些步驟，直到無法進行進一步改進。
 
聚類之后的可視化，目前主要有tSNE和UMAP。兩者都是在高維空間中尋找保持相鄰關系的低維表示方法。
 
Q：tSNE和UMAP的區別？怎么選擇？
一是計算高維距離時，tSNE會計算所有點之間的距離，通過Perplexity（困惑度）參數調整全局結構與局部結構間的軟邊界，而UMAP則只計算各點與最近k個點之間的距離，嚴格限制局部的范圍；另一方面，兩種算法在對信息損失的計算方法不同，tSNE使用KL散度衡量信息損失，在全局結構上存在失真的可能，而UMAP使用二元交叉熵，全局和局部結構均有保留。目前兩種方法在文獻中均有使用，可根據實際情況來進行選擇。
 
本期專題分享到這里就結束啦。感興趣的老師，請持續關注中科新生命10x 單細胞轉錄組常見Q&A，我們下期再見！