細胞在正常的生長活動中會不斷的代謝，需要有各類蛋白酶的參與，當低于-70℃時蛋白酶就會停止工作。所以在超低溫的環境下，可以使細胞停止代謝活動，進入休眠狀態，以便于長期儲存。

實驗材料

基礎材料：

● 基礎培養基

● 血清（常規為FBS/NBS）

● 超凈工作臺

● 無菌二甲基亞砜（DMSO）

● 無菌PBS磷酸鹽緩沖液

● 移液槍

● 電動移液槍

耐思相關耗材：

●  PET/PETG方形試劑瓶[NEST]

●  15mL、50mL無菌離心管[NEST]                        

●  盒裝無菌吸頭[NEST]             

●  血清移液管[NEST]                                                         

●  杯式濾器(0.22μm PES膜) [NEST]                

●  針式濾器 (0.22μm PES膜) [NEST]                                  

●  凍存管[NEST]              

●  自動旋蓋機[NEST]

●  程序降溫盒[NEST]

實驗準備

●   凍存液準備：

一般的細胞：55%基礎培養基+40%牛血清（FBS/NBS）+5%DMSO

重要的細胞：90%牛血清（FBS/NBS）+10%DMSO

凍存液配置完成后，15ml離心管[NEST]分裝，4℃條件下儲存備用。若配置量較大，可分裝入50ml離心管[NEST]，-20℃條件下冷凍儲存。（若牛血清內存在析出沉淀物，采用0.22μm 濾膜過濾除菌）

使用前37℃水浴加熱。

●   待凍存細胞準備：

使細胞凍存前，選擇細胞生長狀態良好，且處于對數生長期的細胞，凍存前12~24h換新鮮培養基維持細胞狀態。
 

實驗流程

1、觀察待凍存細胞密度，約為80%~90%。用移液槍吸出陳舊培養基，加入無菌PBS清洗細胞1-2次，去除培養環境中的殘留培養基。

2、加入適量對應胰酶或消化液，使胰酶沒過細胞，放入培養箱消化。顯微鏡下觀察細胞狀態，胞質回縮，細胞間不再連接成片，此時加入完終止液終止消化。

3、用吸頭輕輕吹打細胞，形成細胞懸液，將細胞懸液1000rpm，離心3-5min。丟棄上清，加入適量預先配制好的凍存液，輕輕吹打使細胞均勻并計數。用凍存液調節的細胞密度，使之終密度為5×106/ml～1×107/ml。

4、用移液槍按照預計容量，分裝入細胞凍存管[NEST]中，采用自動旋蓋機[NEST]旋蓋密封。

5、標準的凍存程序為降溫速率況處-1℃～-2℃/ min，可將待凍存細胞按照以下步驟逐步凍存：室溫→4℃（20min）→-20℃（30min）→-80℃（過夜）→液氮長期保存。

也可將待凍存放入程序降溫盒[NEST]，直接-80℃過夜，再轉移至液氮保存。

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