《Nature子刊》：組合式液滴微流控平臺助力生物分子凝聚體研究
生物分子組裝成凝聚體是細胞內空間組織和細胞功能調節的一個基本過程。繪制和描述生物分子的相行為對理解凝聚體的組裝機制和開發針對生物分子凝聚體系統治療策略至關重要。描述相分離系統的一個核心概念是相圖。相圖通常是通過對參數空間不同部分進行大量單獨測量來建立。但是即使在微孔板格式下進行，過程也是緩慢，低通量的，需要大量的樣品消耗。
近日，來自英國劍橋大學的Tuomas P. J. Knowles教授團隊進行了組合式液滴微流控平臺的生物分子凝聚體相圖相關研究。研究成果以“Biomolecular condensate phase diagrams with a combinatorial microdroplet platform”為題于2022年12月21日發表在《Nat. Commun.》上。
本文提出了一個組合式液滴微流控平臺，稱為PhaseScan，用于快速和高分辨率獲取多維生物分子相圖。利用該平臺對各種條件下系統的相行為進行分析，并證明PhaseScan可以定量分析小分子物質對生物分子相變的影響。
圖1 相位掃描工作流程
微液滴生成和成像的工作流程：作為一個模型系統，研究人員利用EGFP標記的G156E突變體-肉瘤融合蛋白，即肌萎縮性脊髓側索硬化癥（ALS）病理蛋白，可用于相分離研究。通過蛋白質EGFP標簽觀察冷凝物的存在與否，將液滴分為相分離或相均勻。通常情況下，算法的假陽性和假陰性分類誤差總和<4%。凝聚體隨時間的推移而合并，與光漂白（FRAP）實驗后的片外熒光恢復證實了PhaseScan實驗中形成的凝聚體液體性質。通過將確定濃度和相分離存在或不存在以每一液滴為基礎的散點圖結合，產生一個相圖。作為EGFP-FUSG156E和PEG濃度的函數，相邊界的位置和相分離的概率通過支持向量機（SVM）算法對相分離或同質液滴的散點圖群體訓練確定。相分離系統表現為動態變化，凝結液滴在成核后由于生長、凝聚和奧斯特瓦爾德成熟而不斷演變。同時研究液滴大小影響相界位置的可能性發現，液滴體積有調節成核驅動的凝結物生長動態傾向，PhaseScan實驗報告的是相界的平衡位置，對液滴體積不敏感。
圖2 PhaseScan在不同冷凝水系統中的應用
驗證完PhaseScan系統操作后，研究人員圖利用平臺研究不同相分離系統，并測試該方法對同型和異型凝集物系統的通用性。由于核酸共存是相分離核糖核蛋白顆粒的一個決定性特征，首先制作EGFP標記的FUSG156E在有polyU RNA情況下的凝集相圖，FUSG156E相對于RNA低比例下沒有檢測到相分離，在較高FUSG156E濃度下發生相分離。研究表明凝結物的形成和蛋白質-RNA共存是通過電荷中和發生，因此凝結是在RNA與蛋白質離散比率下發生的。
為證明PhaseScan系統對其他相分離蛋白的適用性，對EGFP標記的G3BP1的擁擠驅動相分離進行表征，結果顯示G3BP1的相分離在高濃度PEG分子擁擠劑中出現，在更高蛋白濃度下得到加強。接著研究人員探測了人類冠狀病毒SARS-CoV-2（SARS-CoV-2 N）核衣殼蛋白的相分離，結果顯示：相分離以RNA依賴方式進行，SARS-CoV-2 N相分離可以由RNA存在驅動，過量核酸濃度會導致冷凝液的溶解�？傊�，以上實驗證明PhaseScan方法適用于廣泛冷凝液系統。該檢測方法可用于表征全長蛋白質同型和異型相分離，包括觀察蛋白質-RNA共沉淀物中的再入相分離行為。
圖3 利用PhaseScan探測小分子調節劑對相分離的影響
接著研究小分子對相分離的影響。由于冷凝物形成過程與多種疾病有關，包括神經退行性疾病和癌癥。本研究關鍵在于提供高分辨率相圖，以準確量化小分子調節劑對相分離平衡影響。使用小分bis-ANS對FUSG156E相分離調節，該化合物是各種相分離蛋白有效調節劑。在雙ANS的存在下，相界的位置明顯向低蛋白和低PEG濃度移動�？傊�，PhaseScan方法對小分子添加后蛋白質LLPS行為的變化提供高分辨率評估。許多候選分子的影響是微小的，從一個候選小組中識別潛在物質命中率需要高檢測分辨率。PhaseScan以最小樣品消耗實現高檢測分辨率，為高內容庫的篩選提供有效方式。
圖4 使用PhaseScan平臺生成多維相圖
環境因素可以觸發或調節生物分子相分離。但對環境影響的研究通常局限于二維化學空間分析，PhaseScan平臺能夠自動和高通量地生成大量溶液條件，對FUSG156E進行一個三維（3D）參數空間PhaseScan實驗。在高蛋白和PEG濃度下，相分離更有利。同時在較高濃度1,6-HD下，相分離會減少，因為1,6-HD會通過爭奪主要驅動蛋白質LLPS的疏水相互作用來破壞蛋白質凝聚物。作為蛋白濃度的函數，分子擁擠和1,6-HD對相分離的拮抗作用可以同時觀察。PhaseScan平臺在一次實驗中評估相分離多種調節劑的能力，提供一種方便、高分辨率的手段，可用最小的樣品消耗來研究相分離機理變化。
總之，本文進行了組合式液滴微流控平臺的生物分子凝聚體相圖相關研究。生物分子凝聚已經改變了我們對細胞生物學的理解。PhaseScan平臺通過應用微流控技術，為快速、高分辨率獲得LLPS相圖提供了基礎。PhaseScan方法適用于廣泛相分離系統，包括共存肽、人類蛋白和病毒蛋白，提供了一個有價值的工具，能夠快速、高分辨率分析相分離過程。PhaseScan還能提供高分辨率的相圖，以準確量化小分子調節劑對相分離平衡的影響。同時PhaseScan還允許在一次實驗中探索更高維化學空間。本平臺在篩選候選小分子方面可以實現多種藥物-蛋白質組合的快速篩選。未來實驗可以通過將高頻液滴生成與快速顯微鏡技術相結合，實現更好的檢測產量，為高分辨率和高通量探索蛋白質和核酸在各種條件下的相位變化開辟了一條道路。
文章來源：
https://doi.org/10.1038/s41467-022-35265-7
近日，來自英國劍橋大學的Tuomas P. J. Knowles教授團隊進行了組合式液滴微流控平臺的生物分子凝聚體相圖相關研究。研究成果以“Biomolecular condensate phase diagrams with a combinatorial microdroplet platform”為題于2022年12月21日發表在《Nat. Commun.》上。
本文提出了一個組合式液滴微流控平臺，稱為PhaseScan，用于快速和高分辨率獲取多維生物分子相圖。利用該平臺對各種條件下系統的相行為進行分析，并證明PhaseScan可以定量分析小分子物質對生物分子相變的影響。
微液滴生成和成像的工作流程：作為一個模型系統，研究人員利用EGFP標記的G156E突變體-肉瘤融合蛋白，即肌萎縮性脊髓側索硬化癥（ALS）病理蛋白，可用于相分離研究。通過蛋白質EGFP標簽觀察冷凝物的存在與否，將液滴分為相分離或相均勻。通常情況下，算法的假陽性和假陰性分類誤差總和<4%。凝聚體隨時間的推移而合并，與光漂白（FRAP）實驗后的片外熒光恢復證實了PhaseScan實驗中形成的凝聚體液體性質。通過將確定濃度和相分離存在或不存在以每一液滴為基礎的散點圖結合，產生一個相圖。作為EGFP-FUSG156E和PEG濃度的函數，相邊界的位置和相分離的概率通過支持向量機（SVM）算法對相分離或同質液滴的散點圖群體訓練確定。相分離系統表現為動態變化，凝結液滴在成核后由于生長、凝聚和奧斯特瓦爾德成熟而不斷演變。同時研究液滴大小影響相界位置的可能性發現，液滴體積有調節成核驅動的凝結物生長動態傾向，PhaseScan實驗報告的是相界的平衡位置，對液滴體積不敏感。
驗證完PhaseScan系統操作后，研究人員圖利用平臺研究不同相分離系統，并測試該方法對同型和異型凝集物系統的通用性。由于核酸共存是相分離核糖核蛋白顆粒的一個決定性特征，首先制作EGFP標記的FUSG156E在有polyU RNA情況下的凝集相圖，FUSG156E相對于RNA低比例下沒有檢測到相分離，在較高FUSG156E濃度下發生相分離。研究表明凝結物的形成和蛋白質-RNA共存是通過電荷中和發生，因此凝結是在RNA與蛋白質離散比率下發生的。
為證明PhaseScan系統對其他相分離蛋白的適用性，對EGFP標記的G3BP1的擁擠驅動相分離進行表征，結果顯示G3BP1的相分離在高濃度PEG分子擁擠劑中出現，在更高蛋白濃度下得到加強。接著研究人員探測了人類冠狀病毒SARS-CoV-2（SARS-CoV-2 N）核衣殼蛋白的相分離，結果顯示：相分離以RNA依賴方式進行，SARS-CoV-2 N相分離可以由RNA存在驅動，過量核酸濃度會導致冷凝液的溶解�？傊�，以上實驗證明PhaseScan方法適用于廣泛冷凝液系統。該檢測方法可用于表征全長蛋白質同型和異型相分離，包括觀察蛋白質-RNA共沉淀物中的再入相分離行為。
接著研究小分子對相分離的影響。由于冷凝物形成過程與多種疾病有關，包括神經退行性疾病和癌癥。本研究關鍵在于提供高分辨率相圖，以準確量化小分子調節劑對相分離平衡影響。使用小分bis-ANS對FUSG156E相分離調節，該化合物是各種相分離蛋白有效調節劑。在雙ANS的存在下，相界的位置明顯向低蛋白和低PEG濃度移動�？傊�，PhaseScan方法對小分子添加后蛋白質LLPS行為的變化提供高分辨率評估。許多候選分子的影響是微小的，從一個候選小組中識別潛在物質命中率需要高檢測分辨率。PhaseScan以最小樣品消耗實現高檢測分辨率，為高內容庫的篩選提供有效方式。
環境因素可以觸發或調節生物分子相分離。但對環境影響的研究通常局限于二維化學空間分析，PhaseScan平臺能夠自動和高通量地生成大量溶液條件，對FUSG156E進行一個三維（3D）參數空間PhaseScan實驗。在高蛋白和PEG濃度下，相分離更有利。同時在較高濃度1,6-HD下，相分離會減少，因為1,6-HD會通過爭奪主要驅動蛋白質LLPS的疏水相互作用來破壞蛋白質凝聚物。作為蛋白濃度的函數，分子擁擠和1,6-HD對相分離的拮抗作用可以同時觀察。PhaseScan平臺在一次實驗中評估相分離多種調節劑的能力，提供一種方便、高分辨率的手段，可用最小的樣品消耗來研究相分離機理變化。
總之，本文進行了組合式液滴微流控平臺的生物分子凝聚體相圖相關研究。生物分子凝聚已經改變了我們對細胞生物學的理解。PhaseScan平臺通過應用微流控技術，為快速、高分辨率獲得LLPS相圖提供了基礎。PhaseScan方法適用于廣泛相分離系統，包括共存肽、人類蛋白和病毒蛋白，提供了一個有價值的工具，能夠快速、高分辨率分析相分離過程。PhaseScan還能提供高分辨率的相圖，以準確量化小分子調節劑對相分離平衡的影響。同時PhaseScan還允許在一次實驗中探索更高維化學空間。本平臺在篩選候選小分子方面可以實現多種藥物-蛋白質組合的快速篩選。未來實驗可以通過將高頻液滴生成與快速顯微鏡技術相結合，實現更好的檢測產量，為高分辨率和高通量探索蛋白質和核酸在各種條件下的相位變化開辟了一條道路。
文章來源：
https://doi.org/10.1038/s41467-022-35265-7
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