基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

1. 變性：

在第一輪循環(huán)前,在94℃下變性5-10min 非常重要,它可使模板DNA *解鏈,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復(fù)合物所造成的錯(cuò)誤。變性不*,往往使PCR 失敗,因?yàn)槲醋冃?的DNA 雙鏈會很快復(fù)性,減少DNA 產(chǎn)量.一般變性溫度與時(shí)間為94℃ 1min。在變性溫度下,雙鏈DNA 解鏈只需幾秒鐘即可*,所耗時(shí)間主要是為使反應(yīng)體系*達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟取�對于富含GC 的序列,可適當(dāng)提高變性溫度.但變性溫度過高或時(shí)間過長都會導(dǎo)致酶活性的損失。

2. 退火：

這是PCR 的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm 低5℃, 當(dāng)產(chǎn)物中包含有影響實(shí)驗(yàn)的非可異性擴(kuò)增帶時(shí),以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。如果兩個(gè)引物Tm 不同，將退火溫度設(shè)定為比*低的Tm 低5℃。或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm 設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5 個(gè)循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm 設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。退火溫度越高,所得產(chǎn)物的特異性越高。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并,只用兩種溫度(例如用60℃和94℃)完成整個(gè)擴(kuò)增循環(huán), 既省時(shí)間又提高了特異性。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成,反應(yīng)中所需時(shí)間主要是為使整個(gè)反應(yīng)體系達(dá)到合適的溫度。

3. 延伸：

延伸反應(yīng)通常為72℃,接近于Taq DNA 聚合酶的最適反應(yīng)溫度75℃.實(shí)際上,引物延伸在退火時(shí)即已開始,因?yàn)門aq DNA 聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃.延伸反應(yīng)時(shí)間的長短取決于目的序列的長度和濃度.在一般反應(yīng)體系中,Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成1kb 長的DNA。延伸時(shí)間過長會導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加.但對很低濃度的目的序列, 則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時(shí)間。一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后,都需要一步較長時(shí)間(10-30min)的延伸反應(yīng),以獲得盡可能完整的產(chǎn)物, 這對以后進(jìn)行克隆或測序反應(yīng)尤為重要。

4. 循環(huán)次數(shù)： 

當(dāng)其它參數(shù)確定之后, 循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA 濃度。一般而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多,會使PCR 產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)25-30 輪循環(huán)擴(kuò)增后, 反應(yīng)中Taq DNA 聚合酶已經(jīng)不足, 如果此時(shí)產(chǎn)物量仍不夠, 需要進(jìn)一步擴(kuò)增,可將擴(kuò)增的DNA 樣品稀釋103-105倍作為模板, 重新加入各種反應(yīng)底物進(jìn)行擴(kuò)增, 這樣經(jīng)60 輪循環(huán)后, 擴(kuò)增水平可達(dá)109-1010。擴(kuò)增產(chǎn)物的量還與擴(kuò)增效率有關(guān),擴(kuò)增產(chǎn)物的量可用下列公式表示:C＝Co(1+P)n 。其中：C 為擴(kuò)增產(chǎn)物量,C0 為起始DNA 量, P 為增效率, n 為循環(huán)次數(shù)。在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期會使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反應(yīng)，減少非特異性產(chǎn)物。