超薄切片機需要使用玻璃刀，為電鏡和光鏡提供超薄樣本切片。
對于樹脂切片和冷凍切片（Tokuyasu樣本）的玻璃刀，其刀鋒必須非常鋒利、堅固、穩(wěn)定。采用斷裂法制備優(yōu)質(zhì)玻璃刀時，玻璃條的質(zhì)量非常重要。玻璃條由精選玻璃生產(chǎn)而成，厚度和質(zhì)量均經(jīng)過精確把控。只有采用高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來嚴(yán)格把控公差，才能從一塊玻璃中制出兩把優(yōu)質(zhì)玻璃刀。

圖1：成刀

平衡斷裂概念

在科學(xué)級質(zhì)量的玻璃條中制造受控的筆直斷裂，要求制刀機在劃痕的兩側(cè)施加相同的重量和壓力。此外，從底部接觸玻璃的支撐元件必須盡可能減小表面接觸，以免在斷裂之前對玻璃施加非受控的壓力。
采用平衡斷裂法（圖2）制刀時，一根玻璃條會從中間劃痕處斷裂成相等的兩半。劃痕兩側(cè)的玻璃重量相等，斷裂是平衡的，新產(chǎn)生的斷裂面是平整的。不斷將新產(chǎn)生的玻璃條斷成相等的兩半，可以得到一定數(shù)量的方形玻璃板。

所有方形玻璃板都擁有平直的側(cè)邊以及精準(zhǔn)的直角，而連續(xù)斷裂法得到的方形玻璃板的表面常常會彎曲變形。

圖2：平衡斷裂法

劃痕和斷裂原理

制作高質(zhì)量玻璃刀通常需要制作出一批相等的方形玻璃板，在玻璃上精確地劃出劃痕，精確地施加壓力，使其斷裂。

通常情況下，當(dāng)斷裂發(fā)生在靠近拐角的地方（長劃痕）時，刀鋒更加平直，對面刀肩更窄。過去建議使用短劃痕制作冷凍超薄切片，因為這樣一來自由斷裂的時間較長，可以制得最鋒利、最長的可用刀鋒^{[1, 2]}。

每個劃痕已經(jīng)預(yù)設(shè)好，劃痕距離方塊兩個角的距離相等。斷裂發(fā)生時，玻璃下方墊著兩枚不銹鋼半球，上方則由兩枚斷裂銷固定。這種斷裂可以讓劃痕向其兩側(cè)盡可能地延伸，直至自由斷裂發(fā)生。自由斷裂的方向由斷裂兩側(cè)玻璃的重量以及兩側(cè)施加的力決定。

自由斷裂向方形玻璃板的邊緣彎曲，最終制得一把刀，且刀鋒對面出現(xiàn)平邊（刀肩）（圖3a）。若劃痕沿著方塊的中心延伸，則產(chǎn)生的刀肩會非常窄，此時刀的角度更加接近45°（圖3b）。

這是冷凍超薄切片的優(yōu)選設(shè)置。進行樹脂切片時，則可以將刀肩設(shè)置得稍微大一些（~0.5 mm），產(chǎn)生更大的刀角度，這樣能更加穩(wěn)定。

圖3a

圖3b

玻璃刀真實刀角度

在方形玻璃板上劃出劃痕時，所有劃痕距離方形玻璃板直角還有一定距離。對劃痕兩側(cè)施加壓力，斷裂開始，首先可以看到劃痕開始變深。斷裂沿著劃痕向方形玻璃板兩角延伸。劃痕到達(dá)兩個角后，自由斷裂開始。斷裂沿著劃痕延伸，到達(dá)兩角時向方形玻璃板的一邊偏離彎曲。因此，玻璃刀的真實刀角會略大于劃痕角度。

玻璃刀的真實角度會隨著劃痕偏離對角線角度的增大而增大。這種情況下，刀肩就會變寬。

例如，用方形玻璃板制作玻璃刀時，若刀肩較小（<0.5 mm），則真實刀角度會接近45°。刀肩增大（>0.5 mm）后，會進一步放大真實刀角度，甚至可能使其大于55°（圖4）。

圖4

可用刀鋒長度

在暗場照明下用體式鏡來檢查玻璃刀刀鋒（或用超薄切片機并使用背光燈照明），可以看出刀鋒的中間部分最適合用來做超薄切片。刀鋒右側(cè)有可見的毛刺（鋸齒狀），會使刀的質(zhì)量下降。受應(yīng)力線影響，刀鋒左側(cè)也不適合做切片（圖5）。

從應(yīng)力線離開刀鋒到刀鋒出現(xiàn)毛刺（鋸齒狀），這一段刀鋒可用做超薄切片。

圖5

注 意

• 使用8 mm玻璃條比使用6.4 mm玻璃條多30%可用刀鋒長度！

• 方形玻璃板斷裂成玻璃刀時，施加的力越小，應(yīng)力線就會越快離開刀鋒，鋸齒狀毛刺也更少。這樣一來，可用刀鋒長度就會更長。

檢查刀鋒

制得一對玻璃刀后，可以在超薄切片機上檢查刀鋒質(zhì)量。

使用背光燈照明，將間隙角設(shè)置為最大值，可以看見一道非常細(xì)的白線（圖6）。這條線可用于判斷刀鋒的質(zhì)量，白線必須平直、無塵、無油漬、無指紋、無玻璃毛刺。

另外，也可以使用頂燈照明觀察玻璃刀的刀鋒質(zhì)量（圖7）。

圖8所示玻璃刀質(zhì)量不合格，不能使用。抓取玻璃刀時，指紋留在了刀鋒上。

圖9（頂部）展示了一對玻璃刀，它們在斷裂后并排放置。圖中（圖9底部）還展示了兩把玻璃刀的刀肩細(xì)節(jié)。在斷裂過程中，右側(cè)刀鋒與左側(cè)刀肩對應(yīng)，左側(cè)刀鋒與右側(cè)刀肩對應(yīng)。

圖6

圖7

圖8

圖9

了解更多：徠卡顯微

參考資料：

1. Griffiths G, Simons K, Warren G and Tokuyasu KT: Immunoelectron microscopy using thin, frozen sections: Application to studies of the intracellular transport of Semliki Forest virus spike glycoproteins. In: Methods in Enzymology 466–485 (1983).

2. Tokuyasu KT: Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy 143 (2): 139–149 (1986).