循環腫瘤DNA（ctDNA）分析已成為一種重要的臨床有用的癌癥診斷和治療監測工具。然而，ctDNA檢測由于DNA濃度低，所以在技術上難度大且實驗情況復雜。這篇文章中，科學家們描述了其在Ion Torrent 測序平臺上新開發的一種高靈敏度的ctDNA檢測方法，被稱之為基于雜交和標簽技術的錯誤校正測序（HYTEC-seq）。該方法結合了雜交捕獲和分子標簽，以及新型variant caller PlasmaMutationDetector2以消除背景錯誤。科研家闡述了使用已知突變的對照樣本用HYTEC-seq檢測未知突變時，分析靈敏度高。此外，為了證明這種方法在臨床中的實用性，科學家分析了44例晚期胰腺癌患者的血漿樣本，發現57%的患者存在突變，等位基因頻率低至0.23%。文章發表在NATURE scientific report期刊。

圖 1 （A）HYTEC-seq實驗流程 （B）原始測序reads、單鏈一致序列（SSCSs）和HYTEC-seq測序的每個目標位置的測序錯誤（替換）的相對百分比 （C）三種方法的總體錯誤率

實驗方法
· 樣本制備和cfDNA提取
整個實驗中，科學家選取了四個細胞系和60個健康人的樣本，也檢測了44個病人的血漿樣本。實驗采用50ng Multiplex I cfDNA Reference Standard Set（Horizon）作為標準品驗證HYTEC seq的可靠性。將患者和對照組的外周血收集到EDTA管中，并進行淋巴細胞梯度離心，將血漿在17000×g下離心10 min，去除細胞殘余和剩余血小板。采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen)從血漿中提取cfDNA。提取后的cfDNA儲存在-80℃待用。

· HYTEC seq 文庫設計和構建
該文庫使用Y型接頭適用于Ion Torrent測序平臺，帶有Ion Torrent 平臺的A和P1接頭序列，樣本條形碼序列，和用于錯誤糾正的分子標簽。具體操作如下:
· 將20µL兩種新型的100µM P1和A接頭寡核苷酸序列在50µL的反應體積中分別退火
· 使用PCR儀將接頭寡核苷酸體系加熱到97.5°C，持續150s
· 關閉儀器，等待1小時讓接頭復性
· 將復性后的接頭根據cfDNA加入量用dd水稀釋待用

樣本DNA采取酶打斷法至160pb的片段，并使用磁珠進行富集。片段長度由安捷倫2100生物分析儀進行質控（High Sensitivity DNA kit）。文庫制備采用建庫試劑盒搭配安捷倫的靶向捕獲系統，采用了胰腺癌中常見突變的8個基因的靶向捕獲panel。捕獲到的DNA經PCR擴增后由磁珠富集。最終文庫由安捷倫2100生物分析儀質控。

在這篇測序方法開發的研究中，安捷倫2100生物分析儀又一次展現了其在核酸質控領域的強勢地位。科研家們使用的2100生物分析儀主要原理芯片式毛細管電泳結合微流控技術，操作簡單，檢測靈敏度高。在本次研究中老師選擇的High Sensitivity DNA kit，擁有極高的 DNA 分析靈敏度，適用于低至 5 pg/µL 的片段分析，或低至 100 pg/µL 的 NGS 文庫等復雜 DNA 樣品分析。文中提到的其他試劑耗材以及安捷倫2100生物分析儀配套現貨試劑詳見下表，各位老師走過路過不要錯過！