恩格列凈可減輕內皮炎癥并減弱由糖萼破壞引起的內質網應激信號傳導
內皮糖萼（GCX）是一種富含糖胺聚糖和蛋白聚糖的功能層，分布在內皮細胞內，通過其作為機械傳感器和炎癥細胞附著的屏障作用促進體內平衡。GCX在病理狀況（如2型糖尿病（T2D）和動脈粥樣硬化）中的破壞導致內皮細胞（EC）功能障礙，從而導致心血管疾病進展。特別是，EC GCX的主要成分硫酸乙酰肝素（HS）的體外和體內降解已被證明會損害剪切力調節的一氧化氮（NO）的產生并促進炎癥細胞的粘附。鑒于其在EC穩態中的核心作用，GCX被認為是預防或緩解EC功能障礙的潛在治療靶點，因此有益于臨床結果。

恩格列凈（EMPA）屬于鈉-葡萄糖協同轉運蛋白-2抑制劑（SGLT2i）類藥物，用于治療T2D和心力衰竭。動物研究表明，EMPA對非糖尿病條件下的動脈粥樣硬化、心力衰竭和缺血再灌注損傷具有多效性和擴展保護作用。盡管已經提出了心臟和血管保護機制，EMPA促進EC穩態并進而有助于改善血管健康的確切機制仍有待澄清。

在加拿大麥吉爾大學化學工程系以及健康中心課題組的一項研究中，考慮到GCX健康在EC功能中的重要性以及EMPA改善心血管預后的顯著能力，假設EMPA可以克服由GCX破壞引起的EC功能障礙，這可以部分解釋血管健康的改善。之前已經證明，EMPA可以通過急性降解后恢復的GCX的剪切力機械轉導使ECs的炎癥反應正常化。由于GCX是一個具有再生潛力的動態表層，因此該研究旨在更深入地探索持續GCX破壞下涉及的信號通路，以確定EMPA的其他抗炎機制。

EMPA 誘導的抗炎反應獨立于 HS

持續的HS降解用于評估ECs對獨立于HS的EMPA的炎癥反應。對TNF-α處理的細胞進行炎癥細胞粘附測定，與對照組相比，EMPA顯著降低了NB4細胞粘附（圖1）。雖然持續降解導致NB4細胞粘附顯著增加，顯示出增強的炎癥反應，但EMPA將粘附降低到與未降解組相同的水平，并低于對照組。這表明EMPA可防止ECs對TNF-α刺激和HS降解的炎癥反應。由于它在持續降解下持續存在，因此可以假設EMPA可以獨立于HS減少炎癥。

圖1   剪切培養24小時后的NB4急性早幼粒白血病細胞粘附測定

（a）在有或沒有EMPA處理的持續HS降解下，NB4細胞粘附到TNF-α刺激的ECs的相對數量。與對照組相比，降解導致粘附增加。與對照組相比，EMPA降低了粘附力，并防止了降解引起的增加，導致粘附水平低于對照組。

（b）每種條件的代表性圖像。

ICAM-1 和 eNOS 與 HS 非依賴性 EMPA 抗炎反應無關

通過評估eNOS和ICAM-1的表達，以表征持續HS降解誘導的炎癥反應及其在EMPA提供的恢復效果中的潛在作用。培養24小時后，與TNF-α對照相比，所有靜態和剪切TNF-α+ 條件下的eNOS表達均降低（圖2 a）。未觀察到EMPA和降解對eNOS表達的影響。與無TNF-α的靜態對照相比，剪切力（10 dyne/cm2）顯著提高了磷酸化-eNOS 在Ser1177位點的水平（圖2 b）。在所有剪切條件下，TNF-α刺激使剪切力誘導的磷酸化eNOS Ser1177的增加降低到相似水平，表明eNOS活化降低。同樣，沒有發現由EMPA或降解引起的磷酸化eNOS Ser1177的顯著影響。同樣，TNF-α在所有條件下誘導ICAM-1的表達到相似水平（圖2 c），剪切力、EMPA或降解均無顯著影響。有趣的是，在剪切條件下，有或沒有TNF-α的情況下，磷酸化-eNOS Ser1177/總eNOS比率保持不變，而在靜態培養中發現的比率顯著更高（圖2 d）。這些結果表明，eNOS的激活和ICAM-1的表達與EMPA對EC功能障礙的HS獨立恢復沒有直接關系。

圖2培養24小時后通過蛋白質印跡密度測定進行蛋白表達定量。

評估（a）eNOS、（b）磷酸化eNOS Ser1177、（c）ICAM-1和（d）磷酸化eNOS/總eNOS的比率的表達。（e）代表性條帶和培養條件細節。

由持續HS降解引起的未折疊蛋白反應的誘導部分通過EMPA恢復

為了探索HS和EMPA持續降解影響的可能信號通路，超越GCX的傳統機械生物學和抗炎作用，進行了全基因組轉錄組分析，試圖更好地了解EMPA防止剪切力培養下HS持續降解引發的炎癥反應增加的機制。篩選EC功能障礙相關基因并分組，根據其折疊變化確定所涉及的信號通路。

剪切力下（10 dyne/cm2）暴露24 h顯示，與靜態對照相比，eNOS（NOS3）、KLF2和COX-2（PTGS2）等標志性基因受到調控，炎癥信號基因（IL1B、IL6）下調。剪切力也略微下調了ICAM-1的mRNA表達。

HS在剪切作用下持續降解，導致與未折疊蛋白反應（UPR）和C / EBP同源蛋白（CHOP）轉錄因子相關的基因上調，表明ECs受到內質網（ER）應激的影響。因此，與對照組相比，激活轉錄因子3（ATF3），DNA損傷誘導轉錄本3（DDIT3）和Tribble同源蛋白3 （TRIB3）在HS降解下顯著上調（圖3 a）。通過活化轉錄因子4（ATF4）、真核翻譯起始因子2α激酶3（EIF2AK3；PERK），ER伴侶蛋白Grp78（HSPA5）、生長停滯和DNA損傷誘導蛋白GADD34（PPP1R15A）的上調，UPR的激活也很明顯（圖3 b）。在HS降解下，EMPA顯著降低了ATF3、DDIT3、HSPA5、PPP1R15A、TRIB3的表達。持續HS降解和EMPA誘導的轉錄調控似乎主要通過UPR的PKR樣ER激酶（PERK，EIF2AK3）/真核起始因子2（eIF2）/ATF4分支介導（圖3 c）。這些結果表明，剪切力下的HS降解通過激活UPR促進EC功能障礙，進而激活CHOP介導的細胞凋亡。EMPA處理可通過下調關鍵UPR基因的轉錄水平來減輕ER應激。

圖3   持續HS降解和EMPA處理對ER應激基因轉錄的影響

EMPA通過調節TXNIP潛在地減輕炎癥

EMPA被發現可降低影響氧化應激調節的硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）的表達，并與ER應激有關。實驗發現在靜態培養物中用EMPA處理6小時可下調TXNIP的mRNA表達。暴露于剪切力24小時后，TXNIP mRNA水平顯著降低。持續的HS降解部分消除了剪切了誘導的調控，用EMPA處理通過顯著降低降解引起的升高水平使其表達正常化。持續的HS降解也導致TXNIP蛋白表達顯著增加，與mRNA水平相似，與對照組相比，EMPA使表達正常化。這表明TXNIP可能是ER應激反應的潛在介質，因為它的mRNA和蛋白質表達受到剪切，持續HS降解和EMPA的調節。

N-Acetyl-L-cysteine處理可降低NB4細胞粘附

為了進一步研究由EMPA引起的NB4細胞粘附減少，實驗試圖確定這種效應是否是通過調節剪切力下的氧化應激和HS持續降解介導的。在粘附測定之前，ECs在剪切力下暴露24小時，用N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）處理。與對照組相比，NAC沒有顯著減少粘附的NB4細胞的數量（圖4）。然而，在持續降解的情況下，用NAC處理導致粘附顯著降低，與EMPA提供的效果相當。這可能表明，剪切力暴露期間氧化應激的緩解是EMPA處理的ECs減少其對HS持續降解的炎癥反應的潛在機制。

圖4    用NACNB4進行細胞粘附測定以減輕氧化應激

（a）在剪切培養下處理和持續HS降解后，NB4細胞粘附于TNF-α刺激EC的相對數量。

（b） 每種條件的代表性圖像。

總之，該研究提出了一種可能的機制，通過這種機制，EMPA可能有助于改善內皮健康。研究結果表明，EMPA具有獨立于HS介導的功能而減弱EC炎癥的潛力，如HS持續降解下炎癥細胞粘附的減少所示。EMPA下調促凋亡信號和TXNIP表達可能有助于減輕氧化應激，從而限制ER應激下的氧化損傷，并導致炎癥細胞粘附減少。未來的研究應旨在研究TXNIP通過NLRP3炎癥小體和凋亡信號表達炎癥反應的調控機制。更好地了解SGLT2i對GCX介導的EC功能的影響可能有益于在發現慢性GCX損傷的病理條件下限制EC功能障礙的新策略。

參考文獻：Campeau MA, Leask RL. Empagliflozin mitigates endothelial inflammation and attenuates endoplasmic reticulum stress signaling caused by sustained glycocalyx disruption. Sci Rep. 2022 Jul 25;12(1):12681. doi: 10.1038/s41598-022-16763-6. PMID: 35879337; PMCID: PMC9314417.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35879337/

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