雙抗夾心ELISA實驗的原理及操作解析
目前常用的ELISA方法有直接法、間接法、雙抗夾心法和競爭法，其中，測定蛋白等大分子時雙抗夾心ELISA法是最為常用的一種。雙抗夾心ELISA實驗的操作方法和疑難解析。
雙抗夾心ELISA實驗原理：
雙抗夾心法ELISA是將特異性抗體結(jié)合到固相載體上形成固相抗體（捕獲抗體），然后和待檢樣本中的相應(yīng)抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后再加酶標(biāo)記抗體（檢測抗體），與免疫復(fù)合物中抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗體—抗原—固相抗體復(fù)合物，加底物顯色，判斷抗原含量。整個過程中，待檢抗原經(jīng)過捕獲抗體和檢測抗體雙重篩選，具有高特異性。
雙抗夾心ELISA樣本制備：
1.血清
全血標(biāo)本自然凝集30min后1000×g離心15min，取澄清，即可檢測。澄清可存放于-20℃，避免反復(fù)凍融。
2.血漿
可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30min內(nèi)于2-8℃、1000×g離心15min，或?qū)?biāo)本放于-20℃，避免反復(fù)凍融。（注意：標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測）
3.細(xì)胞上清
收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心取上清，-20℃存放，避免反復(fù)凍融。
4.細(xì)胞裂解樣本
1）.收集細(xì)胞后，用預(yù)冷的10mM PBS洗3次，5000×g離心5min。
2）.細(xì)胞計數(shù)，離心棄上清；
3）.加PMSF至細(xì)胞裂解液中，終濃度為1mM；
4）.按每1×107個細(xì)胞，加入1ml細(xì)胞裂解液（含PMSF），冰上裂解 30min，其間上下顛倒使裂解更充分，超聲波破碎處理；
5）.4℃，10000×g離心10min；
6）.檢測細(xì)胞裂解樣本總蛋白濃度；
7）.整個過程需在冰上操作，防止蛋白降解。
5.組織裂解樣本
1.加PMSF至細(xì)胞裂解液中，終濃度為1mM；
2.預(yù)先將待檢組織用剪刀剪碎，液氮研磨，再按每100mg組織加1 mL裂解液，用研磨器進(jìn)行研磨，得到的勻漿液可利用超聲破碎處理；
3.4℃，10000×g離心10min，取上清，-80℃存放；
4.檢測組織裂解樣本總蛋白濃度；
5.整個過程需在冰上操作，防止蛋白降解。
6.尿液
收集尿液后，1000×g離心20min，取上清，-20℃或者-80℃存放，避免反復(fù)凍融。
7.人乳
收集樣本后，10000×g離心15min，取澄清部分，渾濁液再次離心，取澄清，收集澄清部分，-20℃存放，避免反復(fù)凍融。
雙抗夾心ELISA操作步驟：
ELISA實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）。試劑或樣品稀釋時，確保混勻，同時盡量避免起泡。
1.包被抗體：用碳酸鹽緩沖液（CBS）或者磷酸鹽緩沖液（PBS）根據(jù)實驗需要，將包被抗體稀釋到一定的稀釋度，100μl/孔包被， 37℃、2h或者4℃過夜。
2.洗板：棄孔內(nèi)液體，甩干，10mM PBST(10mM PBS 0.05% Tween-20)洗板2次，每次浸泡1-2min， 350μl/孔，甩干（也可以輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
3.封閉：含1% BSA或者5%脫脂牛奶的10mM PBST(10mM PBS 0.05% Tween-20)做封閉液，350-400μl/孔，37℃、2h。
4.洗板：同步驟2。（備注：商品化試劑盒一般已經(jīng)預(yù)包被了包被抗體在酶標(biāo)板上，不需要進(jìn)行1-4步驟，使用前請注意核實）。
5.加樣：分別設(shè)零孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl。（注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，一塊板要在10 min內(nèi)上完樣品。）酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)60-120min。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
6.洗板：棄孔內(nèi)液體，甩干，10mM PBST（10mM PBS 0.05% Tween-20）洗板4次，每次浸泡1-2min，350-400μl/孔，甩干（也可以輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
7.加檢測抗體：根據(jù)實驗需要，將檢測抗體用PBST稀釋到一定的稀釋度，100μl/孔，37℃、1h。
8.洗板：同步驟6。
9.加二抗：根據(jù)實驗需要，將二抗用10mM PBST稀釋到一定的稀釋度，100μl/孔，37℃、1h。
10.洗板：同步驟6。
11.酶標(biāo)儀讀值：以630nm為校正波長，用酶標(biāo)儀在450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值），在加終止液后5min內(nèi)進(jìn)行讀數(shù)。
12.結(jié)果判斷：
1）.每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的OD值須減去零孔的OD值，如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值；
2）.以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行四參數(shù)擬合（4-PL），如Origin、ELISACalc等，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出相應(yīng)的擬合濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為樣本的測定濃度。
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