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RT-PCR的原理與操作步驟

瀏覽次數:458 發布日期:2022-10-17  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
RT-PCR是指將逆轉錄(Reverse Transcription;RT)反應和PCR (Polymerase Chain Reaction)反應組合在一起的方法。

一、 RT-PCR的原理:
RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結合在一起,提供了一種分析基因表達的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對表達信息進行檢測或定量。另外,這項技術還可以用來檢測基因表達差異或不必構建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內的RNA分析技術,更靈敏,更易于操作。 RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉錄反應可以使用逆轉錄酶,以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物(GSP)起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中,每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉錄緩沖液中進行,然后取出1/10的反應產物進行PCR。在一步法RT-PCR中,逆轉錄和PCR在同時為逆轉錄和PCR優化的條件下,在一只管中順次進行。

二、RT-PCR的步驟:
1、在冰浴離心管里面加入模板RNA 4uL,引物2uL,去離子水5uL,混勻,離心3-5秒;
2、70度水浴5分鐘,冰浴30秒(此處是為了使引物和模板正確配對);
3、加入5×反應液4uL,RNase抑制劑1uL,dNTP 2uL(這些應該先配好,然后分再裝到每一管),混勻;
4、37度水浴5分鐘,加入1uL AMV-RT反轉錄酶,混勻;
5、37度水浴1小時(此步是反轉錄過程);
6、70度10分鐘結束反應(此處是滅活酶活性,避免對后續實驗產生干擾),產物置冰上進行下一步PCR實驗,余下的-70度保存。
 
發布者:上海邦景實業有限公司銷售部
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