細胞培養的主要過程步驟
瀏覽次數:362 發布日期:2022-10-6
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細胞培養是研究病毒與研制疫苗的基礎技術,因此細胞培養技術在遺傳學、免疫學、腫瘤學、病毒學、分子生物學等領域已得到廣泛的應用。近年來發展起來的核移植、細胞雜交、DNA介導的基因轉移以及一些物理圖譜的建立,也都需要與細胞培養緊密結合。
細胞培養一般主要過程包括以下幾點:
1.準備工作:準備工作的內容包括器皿的清洗、干燥與消毒,培養基與其他試劑的配制、分裝及滅菌,無菌室或超凈臺的清潔與消毒,培養箱及其他儀器的檢查與調試。
2.取材:在無菌環境下從機體取出某種組織細胞(視實驗目的而定),經過一定的處理(如消化分散細胞、分離等)后接入培養器皿中,這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的首次培養稱為原代培養。
3.培養:將取得的組織細胞接入培養瓶或培養板中的過程稱為培養。如系組織塊培養,則直接將組織塊接入培養器皿底部,幾個小時后組織塊可貼牢在底部,再加入培養基。
4.凍存及復蘇:為了保存細胞,特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株,要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度-196℃,將細胞收集至凍存管中加入含保護劑(一般為二甲亞砜或甘油)的培養基,以一定的冷卻速度凍存,zui終保存于液氮中。在J低的溫度下,細胞保存的時間幾乎是無限的。復蘇一般采用快融方法,即從液氮中取出凍存管后,立即放入37℃水中,使之在一分鐘內迅速融解。然后將細胞轉入培養器皿中進行培養。
細胞原代培養的基本步驟:
原代分離細胞培養是指從供體內取出組織后,經機械以及消化分離成單個細胞或單一型細胞群,使之在體外模擬人體生理環境,在無菌、適當溫度和一定的營養條件下,生存、生長和繁殖。原代培養細胞常有不同的細胞成分,生長緩慢,但是更能代表所來源的組織細胞類型和表達組織的特異性特征。利用原代細胞培養做各種實驗,如藥物測試、細胞分化及病毒學方面的試驗效果很好。
其操作步驟如下:
1.剪切組織:先將所取得的組織,用D-Hanks或Hanks液清洗,以去除表面血污,并用手術鑷去除黏附的結締組織等非培養所需組織。再次清洗后,用手術刀將組織切成若干小塊,移入青霉素小瓶或小燒杯中,加入適量緩沖液,用彎頭眼科剪,反復剪切組織,直到組織成糊狀,約1mm3大小。靜置片刻后,用吸管吸去上層液體,加入適當的緩沖液再清洗一次。
2.消化分離:消化分離的目的是將細小的組織塊消化分離成細胞團或分散的單個細胞,以利于進一步的培養,常用的消化酶有胰蛋白酶和膠原酶。
3.培養:細胞懸液用計數板進行細胞計數。用培養液將細胞數調整為(2~5)×105 cells/ml,或實驗所需密度,分裝于培養瓶中,使細胞懸液的量以覆蓋后略高于培養瓶底部為宜。置CO2培養箱內,5%CO2,37℃靜置培養。一般3~5d,原代培養細胞可以黏附于瓶壁,并伸展開始生長,可補加原培養液量1/2的新培養液,繼續培養2~3d后換液,一般7~14d可以長滿瓶壁,進行傳代。