流式細胞術在CAR-T臨床研發前的應用
嵌合抗原受體T細胞免疫療法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T)，是通過基因工程技術將自體或異體T細胞改造成針對腫瘤特異性抗原的新型殺傷細胞，該療法已經在血液腫瘤的治療上取得了矚目的成效。CAR-T細胞免疫療法的臨床前研究，是成藥中關鍵且漫長的一步，包括了靶點發現、抗體的開發、scFv篩選、CAR-T細胞的構建、CAR-T細胞體外抗腫瘤活性和CAR-T細胞體內抗腫瘤活性評估等多個重要環節。
流式細胞術是一種可對懸浮于流體中的微小顆粒進行計數和分選的技術，由于其高效、簡便、準確等特點，已經廣泛應用于CAR-T細胞治療的各個環節。下面帶大家了解流式細胞術在CAR-T臨床研發前的應用。
一、檢測靶點抗原的表達豐度
CAR-T細胞通過其scFv精準識別腫瘤細胞上的抗原并發揮殺傷作用，因此篩選理想的靶點抗原是一個重要的步驟。篩選高特異性的靶點抗原，需要檢測靶點抗原在所有細胞中的表達豐度，篩選到在腫瘤細胞高表達且在正常細胞不表達或低表達的抗原，以此盡可能避免CAR-T細胞療法的毒副作用。流式細胞術在這個過程中有重要的應用。比如下面的報道中，作者通過流式細胞術檢測了靶點抗原BCMA的分布情況，發現BCMA在正常和腫瘤PC細胞上均高表達。而在正常組織中不表達或低表達。
圖1 流式細胞術檢測靶點抗原的表達豐度[1]
二、病毒滴度檢測
CAR-T臨床研發前需要構建CAR-T細胞和抗原過表達的腫瘤細胞模型，用于后續評估CAR-T細胞的抗腫瘤能力。一般而言，通過能夠編碼目的序列的慢病毒來侵染對應的細胞系，可高效構建上述的穩轉細胞模型。在這個過程中，慢病毒的滴度是受到嚴格質控的。流式細胞術是其中一種檢測慢病毒活性滴度的重要手段。下面以一個實例介紹流式細胞術在慢病毒滴度檢測方面的應用：
我們需要檢測CD19抗原慢病毒的滴度，將能編碼CD19抗原的慢病毒純化液以0.01、0.1、1、10μl四個梯度分別加入到事先接種的293T細胞中，72小時后流式檢測293T細胞CD19抗原的陽性率（即被慢病毒感染的293T細胞占細胞總數的百分比），進而按如下公式計算慢病毒的轉導滴度：
A：表示0.1μl組陽性細胞占比
B：表示0.01μl組陽性細胞占比
N：加入病毒時候細胞數量
V：表示A組中病毒的加入體積
圖2 CD19抗原慢病毒滴度檢測結果
（數據來源：賽業生物）
如圖所示，CD19抗原陽性細胞的數量隨轉染病毒梯度的增加而逐漸升高，表明該慢病毒有良好的感染活性，并按上述公式計算病毒滴度為：1.4×108Tu/ml。
同樣地，采用上述方法檢測CD19 CAR慢病毒滴度，經計算后得到病毒滴度約為：4.33×108Tu/ml。
圖3 FMC63 CAR慢病毒滴度檢測結果
（數據來源：賽業生物）
三、CAR-T細胞表型分析以及CAR陽性率（或過表達抗原細胞模型的抗原陽性率）
對于構建好的CAR-T細胞，在進行功能驗證前需要檢測其表型和CAR分子的陽性率。流式細胞術可有效檢測CAR-T細胞表面的標志蛋白和CAR分子的陽性率。同理，對于構建的過表達抗原細胞模型，也可通過流式細胞術檢測抗原表達情況。下面通過實例進行介紹。
▶ 檢測T細胞的表型及CD19 CAR-T細胞陽性率陽性率
對兩種方法制備T細胞用抗體標記后表型進行分析，結果顯示兩種方法均能獲得高純度的T細胞，但二者擴增出來的不同亞型T細胞的占比有較大的差異，Method1擴增出來的T細胞以CD8+T細胞亞型為主，而Method2可擴增出CD8+T細胞和CD4+T細胞占比差異較小的T細胞群體，這兩種方法為研究不同亞型T細胞的作用奠定了堅實的基礎。同時，我們用CD19 CAR慢病毒轉染Method1擴增出來的T細胞，構建CD19 CAR-T細胞，并使用流式法檢測CAR蛋白的表達效率，結果顯示CD19 CAR-T的陽性率可達到45.59%，表明我們成功構建了CD19 CAR-T細胞。
圖4 T細胞表型分析及FMC63 CAR-T細胞陽性率檢測。A.PBMC活化擴增第十天T細胞占比及表型分析實驗結果。B.FMC63 CAR-T細胞CAR陽性率檢測結果。（數據來源：賽業生物）
▶ 質控CD19-293T細胞株構建
通過CD19慢病毒感染293T細胞，構建CD19穩定表達的293T細胞株，并采用流式檢測其抗原CD19的高表達。
四、體外檢測CD19 CAR-T細胞的殺傷效果
將CAR-T細胞與腫瘤細胞或構建的抗原過表達細胞模型混合，檢測腫瘤細胞或抗原過表達細胞模型的死亡，可反映CAR-T細胞殺傷效果。其中，通過流式細胞術可檢測腫瘤細胞的凋亡情況。如下面的這個實例：
將CD19 CAR-T細胞和T細胞分別以不同效靶比同Nalm6細胞共孵育48h，隨后流式法檢測腫瘤細胞凋亡。如圖所示，與T細胞組相比，不同效靶比條件下，CD19 CAR-T細胞均展現出了對Nalm6細胞明顯增強的特異性細胞毒性作用。同時細胞培養上清中細胞因子含量檢測結果也顯示，同腫瘤細胞共孵育后CD19 CAR-T細胞因子IFN-γ分泌量相比于T細胞具有顯著的增強。
五、監控體內CAR-T細胞的治療效果
在體外驗證CAR-T細胞的表型與殺傷效果后，就可以進行體內實驗。將CAR-T細胞注射到腫瘤小鼠模型（比如：NSG，C-NKG，NOG等），接著取不同天數的外周血樣（Peripheral blood, PB），使用流式細胞術分析，便可以監測CAR-T細胞在體內的增殖活性、細胞表型和殺傷能力。
六、總結
CAR-T療法是腫瘤治療領域最具前景的方向之一，是一種“治愈”癌癥的治療方法。其臨床前研究需要經歷多個重要的環節，而每個環節都需要嚴格的質控標準。近年來，隨著流式細胞術的不斷發展，并且基于其自身的優勢特點，必將更廣泛的應用于CAR-T細胞治療產品開發的各個環節。
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參考文獻：
Bu DX, Singh R, Choi EE, et al. Pre-clinical validation of B cell maturation antigen (BCMA) as a target for T cell immunotherapy of multiple myeloma. Oncotarget. 2018;9(40):25764-25780.
