普瑞邦免疫親和柱在維生素B12檢測新國標實施發布的應用
維生素B12是一類含有咕啉(corrin)環的類咕啉(corrinoids)化合物，其通俗名稱又叫做鈷胺素(cobalamin)，是唯一的一類含金屬元素的維生素。維生素B12的化學結構如下圖所示，根據咕啉環軸向上方的R基不同，形成了不同類型的維生素B12類物質。如羥基（-OH）與咕啉環中的鈷離子相連形成羥基鈷胺素（hydroxycobalamin），同樣，脫氧腺苷（5'-deoxyadenosyl）、甲基（-CH3）、氰基（-CN）與鈷離子相連分別生成腺苷鈷胺素（deoxyadenosylcobalamin）、甲基鈷胺素（methylcobalamin）和氰鈷胺素（cyanocobalamin）。日常生活中所稱的維生素B12更多是指氰鈷胺素，因其易結晶，不易被空氣氧化，所以常被用作維生素B12的食品添加劑形式。
人體不能合成維生素B12，主要依靠動物性食品提供，含量豐富者有肝腎組織、肉類、蛋類和乳類制品等。此外特殊保健食品、功能性飲料等食品中也會含有相對較多的維生素B12。維生素B12在人體代謝當中起到非常重要的作用，缺乏維生素B12不僅會導致貧血，還會引起心臟病、神經紊亂、生育與出生缺陷以及癌癥等。因此一種或幾種能夠精確檢測食品中維生素B12含量的方法十分重要。目前常用的主要有比色測定法、微生物營養缺陷型測定法、酶聯免疫吸附測定法、高效液相色譜法以及高效液相色譜串聯質譜法等方法。需要考慮的因素有：動物性食品中維生素B12同時有多種存在形式，如何準確測定其真實含量。其次需要將結合態維生素B12從鈷胺素結合蛋白中游離出來。還有維生素B12在食品中含量較低，如何有效富集等問題。近期新發布的國標《GB 5009.285-2022食品安全國家標準 食品中維生素B12的測定》給我們提供了合適的解決方案。
我國現行的國標為《GB 5413.14-2010 食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定》采用的是微生物法，僅適用于嬰幼兒食品、乳及乳制品中維生素B12的檢測。國際現行方法也是微生物法，美國 AOAC 986.23方法即采用微生物法測定乳基嬰幼兒配方粉中的維生素B12。此外AOAC 2011.10方法采用雙柱切換-液相色譜-紫外檢測法測定嬰兒配方奶粉和成人營養品中的維生素B12。值得一提的是，在2010版國標修訂征求意見稿中也曾將固相萃取-在線柱切換高效液相色譜法納入本標準，但未能出現在最新標準中。
新國標解讀：
新國標2022版第一法為液相色譜法，適用于嬰幼兒食品、乳及乳制品、肉及肉制品中維生素B12的測定。因其檢測設備和耗材較為廉價、準確度較高而值得推廣。第二法為液相色譜-質譜法，適用于嬰幼兒食品、乳及乳制品、肉及肉制品、即食谷物、烘焙食品、果凍、飲料中維生素B12測定。該方法是將分離性能優異的液相色譜法與靈敏度更高、能提供相對分子質量和結構信息的質譜法相結合的現代分離分析技術，同時結合使用我司獨立研發維生素B12同位素內標，能對維生素B12更加快速、準確的定量，而且能解決飲料等低含量樣品的定量檢測難題。第三法仍為微生物法，適用于嬰幼兒食品、乳及乳制品中維生素B12的測定。
通過以上對比發現，新國標2022版中增加了多種復雜的樣品基質，提高了方法的適用性，通過使用高特異性的免疫親和柱以及維生素B12同位素內標解決了當前維生素B12分析檢測的難題。在對應的第一法前處理中，試樣經酶解后，用氰化鉀（或氰化鈉）溶液將鈷胺素異構體（羥鈷胺素、甲鈷胺素和5-脫氧腺苷鈷胺素等轉化為氰鈷胺素，樣液通過免疫親和柱凈化、濃縮后，反相液相色譜柱分離，紫外檢測器檢測。
維生素B12及其內標的液相色譜-質譜圖
在對應第二法前處理中，稱取試樣后要先加入適量的同位素內標，再按第一法相同操作處理，最后由質譜檢測器分析，因同位素內標的使用，可以有效地校正基質效應和前處理損失，使結果更加精確。
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