各位老師大家好！新一期10×單細胞轉(zhuǎn)錄組常見Q&A又來了！上一期中，我們介紹了單細胞實驗開展前最需要了解的幾大問題（點擊閱讀）。這一期，我們將為大家介紹單細胞實驗環(huán)節(jié)中的質(zhì)控細節(jié)。

1. transcriptional bursting
首先，給大家介紹轉(zhuǎn)錄表達中的一個現(xiàn)象：轉(zhuǎn)錄爆發(fā)（Transcriptional bursting），是指基因會從沉默的狀態(tài)突然切換為激活態(tài)，啟動轉(zhuǎn)錄、并在短時間內(nèi)（通常不超過2-3min）急劇生成產(chǎn)生大量RNA；然后再次進入沉默的狀態(tài)。 我們都知道，基因的轉(zhuǎn)錄和表達是有周期性的。當(dāng)基因的轉(zhuǎn)錄被激活時，mRNA的水平會突然上升，然后慢慢下降，而相應(yīng)的蛋白水平的變化會有一定的滯后。這種周期的頻率，以及每次波動的大小，在RNA分析中都會影響最終的表達量（可以是FPKM值、RPKM值）。這種周期性的轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，就是同transcriptional bursting有關(guān)。
 
2. 單細胞實驗整體流程
在bulk RNA測序過程中，由于RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增流程，會存在偏好性的問題。同樣的，單細胞轉(zhuǎn)錄組實驗中也存在偏好性，如擴增、Drop-out rates（有部分高表達的mRNA 無法被擴增出來）、Transcriptional bursting、背景噪音、細胞周期與細胞大小、以及批次效應(yīng)帶來的偏好性。
單細胞實驗整體流程如下圖，接下來給大家詳細講解一下哪些實驗環(huán)節(jié)會帶來偏好性，以及如何發(fā)現(xiàn)和質(zhì)控。
2.1 細胞分離
我們在做單細胞測序的時候，首先要做細胞分離。細胞分離必須要在較短時間內(nèi)完成，否則會影響到細胞的狀態(tài)，甚至可能導(dǎo)致RNA從細胞中漏出。
從組織中分離出單細胞可能遇到的問題：
1、細胞分離的不徹底，存在多個細胞黏連到一起的情況；
2、細胞分離條件對所有細胞類型不適中，會對一些細胞造成損傷，使RNA溢出；
3、溢出的RNA，導(dǎo)致了背景信號；  
細胞分離過程可能會產(chǎn)生偏好性。例如分離出的細胞可能只是一些特定細胞。因此對于聚類的結(jié)果，要進行仔細檢查，以發(fā)現(xiàn)某一群細胞中特異表達的基因是否存在著會由細胞分離實驗所引起的高表達基因。中科有著專業(yè)的實驗團隊，可以選擇最優(yōu)的細胞分離方案，在保證細胞活率大于80%的同時，降低偏好性的影響。
 
2.2 細胞分選
在做細胞分選的過程中會遇到如下的問題：
1、現(xiàn)有的單細胞測序都會遇到有些drople可能是空的或者存在多個細胞；
2、對于細胞的類型也往往存在偏好性，如中性粒細胞等；
3、分選實驗持續(xù)時間過長會損害細胞，造成背景噪音；
因此，選擇合適的單細胞測序策略尤為重要。Chromium X相較之前的型號，額外增加了溫控系統(tǒng)，可以使整個系統(tǒng)始終在恒定條件下運行，降低批次效應(yīng)，提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。通過微流控系統(tǒng)將單個細胞與Gel Beads結(jié)合形成GEMs，細胞捕獲率65%，雙細胞捕獲率為0.4%/1000個細胞，上機一次運行的時間不超過18min。  
2.3 細胞裂解
在做單細胞測序之前，需要對GEMs中細胞進行裂解。不同的細胞組織，裂解條件也會不一樣，如果裂解條件過于嚴格，就會影響文庫制備。中科單細胞實驗團隊會根據(jù)不同細胞類型選擇合適的裂解條件，確保后續(xù)文庫制備正常。
 
2.4 反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增
在GEMs中細胞裂解后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄（RT），形成10×Bacoded cDNA，
再進行PCR擴增，質(zhì)控要求cDNA總量＞100ng（濃度＞2.22ng/μl），片段分布在500bp-3000bp。由于不同細胞的擴增條件是不同的，但是在單細胞在擴增時的擴增條件單一，必然就會使得不同細胞的擴增效率存在不同，此外，PCR本身循環(huán)擴增過程中也會存在bias。但得益于Gel Beads中的UMI（對基因絕對定量），無論基因被擴增多少次，只對UMI計數(shù)一次，這消除了PCR擴增帶來的偏好性。
2.5 文庫構(gòu)建和測序
對構(gòu)建好的單細胞文庫進行質(zhì)檢，文庫濃度一般比cDNA濃度高出10倍以上。片段分布在300-600bp，主峰落在450bp左右。最后將質(zhì)檢合格的文庫上機測序，整個單細胞實驗環(huán)節(jié)到此就結(jié)束了！
總結(jié)
相信大家閱讀完以上內(nèi)容，已經(jīng)對單細胞測序整體實驗流程的質(zhì)控細節(jié)有一定了解了。下一期會給大家?guī)�來分析環(huán)節(jié)的質(zhì)控內(nèi)容，敬請期待！