貼壁細胞的培養(yǎng)

（１）貼壁細胞的復蘇

在準備進行細胞復蘇實驗時，應提前做好一下兩點準備：1.提前把超凈工作臺紫外滅菌30分鐘；2.提前把水浴鍋打開，使水溫保持在37攝氏度，并預熱復蘇細胞所用的培養(yǎng)基。上述準備工作完成以后就可以從液氮中取出保存的細胞，本著“慢凍速融”的原則，把細胞放進水溫３７攝氏度的水浴鍋中并不斷攪拌，使冷凍的細胞迅速融化，最大限度的保存細胞的活力，這個過程最好在兩分鐘之內完成。細胞解凍后放在離心機中以1000rpm的轉速離心3-5分鐘，離心結束小心棄去上清，并用提前預熱的完全培養(yǎng)基把細胞吹打混勻，再轉移至規(guī)格合適的培養(yǎng)器皿中，放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)即可。

（２）貼壁細胞的傳代

當我們在準備給貼壁細胞進行傳代的時候應該確認以下兩點：1.先把細胞從細胞培養(yǎng)箱中拿出，放在顯微鏡下觀察，確保細胞狀態(tài)良好，沒有污染；2.觀察細胞的匯合度達到70%-90%，細胞匯合度太低或者太高時對細胞進行傳代均不利于細胞生長。只有滿足這兩點基本條件，我們才能給細胞傳代。給細胞傳代時，首先我們棄去培養(yǎng)基，用pH=7.4的無菌的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗細胞2-3次，動作要輕柔防止細胞脫落。清洗完細胞后再加入終濃度為0.25%的胰蛋白酶消化液消化細胞，消化過程中把細胞放在顯微鏡下觀察，直到細胞被消化成一個一個單獨的小圓球時加入完全培養(yǎng)基終止細胞消化，消化時間要把握好，消化時間太短細胞沒有消化下來，時間太長則會影響細胞活性。消化下來的細胞吹打混勻后以1:3-5的比例分裝到新的培養(yǎng)器皿中再加入足量的完全培養(yǎng)基繼續(xù)擴大培養(yǎng)。

（３）貼壁細胞的凍存

凍存細胞時，首先我們棄去培養(yǎng)基，用pH=7.4的無菌的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗細胞2-3次，動作要輕柔防止細胞脫落。清洗完細胞后再加入終濃度為0.25%的胰蛋白酶消化液消化細胞，消化過程中把細胞放在顯微鏡下觀察，直到細胞被消化成一個一個單獨的小圓球時加入完全培養(yǎng)基終止細胞消化，消化下來的細胞吹打混勻后，按照以下比例混勻放入凍存管中：60%的胎牛血清（FBS）＋30％細胞懸液＋10%二甲基亞砜（DMSO）。特別值得注意的是，在凍存管上要標注清楚凍存的細胞名稱，細胞凍存的時間，凍存細胞的代數(shù)等信息。本著“慢凍速融”的原則，我們把寫好信息的凍存管放入慢凍盒中，放入負八十度冰箱冷藏十二個小時后再把細胞取出放入液氮中保存。

貼壁細胞的轉染

在準備做細胞轉染的前一天我們把細胞鋪進細胞培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，使得細胞匯合度達到百分之六十到百分之八十。在轉染前需要把完全培養(yǎng)基換成無雙抗的完全培養(yǎng)基，以排除雙抗對轉染效率的影響。根據(jù)轉染的細胞數(shù)不同選取適量的純培養(yǎng)基分別稀釋質粒和lipo3000，其中稀釋完的質粒中加入p3000充分混勻后再加入稀釋過的lipo3000中，把混合液輕柔的吹打混勻，室溫孵育20分鐘。孵育結束后把質粒-p3000-lipo3000混合液加入細胞培養(yǎng)皿中，然后再輕輕搖勻，放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6個小時，再更換成帶有雙抗的完全培養(yǎng)基即可。