培養細胞純化的兩大方法
 

細胞的純化一般分為自然純化和人工純化兩大類。可根據不同細胞種類、來源、實驗要求和目的而選擇不同的純化方法。下面主要介紹一些基本的方法。

自然純化即利用某一種類細胞的增殖優勢，排擠其他細胞生長，靠自然的增殖潛力最后留下生長優勢細胞，去除其他細胞，達到細胞純化的目的。但這種方法常無法人為的選擇細胞，時間長，多數情況下，剩下的都是成纖維細胞，因此，僅有些惡性腫瘤細胞可以通過此方法，自然純化而建立細胞系。

利用人為手段造成對某一細胞生長有利的環境條件，抑制其他細胞的生長，從而達到純化細胞的目的。
 

1.酶消化法

①概述：由于上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶的耐受性不同，成纖維細胞對胰蛋白酶比較敏感，而上皮細胞對胰蛋白酶的耐受性較高，因此，在消化培養細胞時，成纖維細胞先脫壁，而上皮細胞要消化相當長的時間才脫壁，特別是原代培養和培養早期,這種差異尤為明顯，因而可以利用這種差異采用多次差別消化方法，將上皮細胞和成纖維細胞分開達到純化細胞的目的。

②方法：采用普通消化傳代方法，將0.25%胰蛋白酶注入培養瓶內兩次，每次加1 mL(25 mL培養瓶)，稍加搖動讓胰蛋白酶流過所有細胞表面，然后倒掉。蓋好瓶蓋，將培養瓶放在倒置顯微鏡下觀察，發現纖維樣細胞變圓，部分脫壁，立即加入2mL有血清培養液，終止消化。用彎頭吸管輕輕吹打纖維樣細胞生長的區域(可事先在顯微鏡下用記號筆在培養瓶上畫出記號)。吹打過程中不要用力，也不要吹上皮細胞生長區域。吹打結束后，再用少量培養液漂洗一遍，然后加入適量培養液繼續培養，也可重復上述操作再進行一次，或隔幾日后或下次傳代時，再進行上述操作。經過幾次處理可以將成纖維細胞去除或將兩者分開。
 

2.機械劃除法

(1)概述：原代培養成功后，上皮細胞和成纖維細胞多數都同時出現，混雜生長。這種混雜生長常常分區呈片，每種細胞都以小片或區域性分布的方式生長在瓶壁上。因此可以采用機械的方法去除不需要的細胞的區域，而保留需要的。
(2)方法：將要純化細胞的培養瓶，放在倒置顯微鏡監視下進行。用彎頭滴管在不需要生長的細胞區域推劃，使細胞脫壁懸浮在培養液中，注意不要傷及所需細胞;推劃后用培養液沖洗兩次，即可加培養液繼續培養;數日后如發現不需要的細胞又長出，可再進行上述操作，這樣反復多次可以純化細胞。操作過程要嚴格無菌操作，防止污染。
 

3.反復貼壁法

(1)概述：成纖維細胞與上皮細胞相比，其貼壁過程快，大部分細胞常能在10~30 min完成附著過程(但不一定完全伸展);而上皮細胞大部分在短時間內不能附著或附著不穩定，稍加振蕩即浮起。利用不同細胞貼壁速度不同的特點，經過反復貼壁，可以將早期傳代培養中的成纖維細胞和上皮細胞分開。

(2)方法：將細胞懸液接種到一個培養瓶內(最好用無血清培養，因為在無血清支持下，上皮細胞貼壁更慢)靜置20 min;在顯微鏡下觀察，見細胞部分貼壁，稍加搖蕩也不浮起時，將培養液連同尚未貼壁細胞一起倒出或吸到另一培養瓶;繼續培養或重復上述操作，將上皮細胞和成纖維細胞逐步分隔開。
 

4.克隆法

在同一細胞系中，存在不同的細胞株，它們的功能和生長特點僅略有不同，要純化出某一種細胞，用上述方法常不能將同一細胞系的不同株分開，可采用細胞克隆的方法。

具體過程是采用細胞克隆法將細胞分成單個細胞，使之分別生長成克隆，然后對每一克隆進行測試，選擇出所需要的克隆。

5.培養基限定方法

某些細胞在生長過程中必須存在或去除某種物質，否則將無法生長，而其他細胞與之相反。可以利用這種技術來純化細胞。如雜交瘤技術中常用的HAT培養液，就用來篩選雜交瘤細胞而抑制其他細胞。

6.流式細胞儀分離法

流式細胞儀可根據細胞核酸含量、某些物質含量或細胞結構大小等參數來將細胞分離成不同的群體。

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