原位測序 (ISS) 是一種新方法，通過該方法直接在固定組織或細胞樣品的切片中對 mRNA 進行測序。原位測序原理關鍵是測序信息與其位置之間的聯系—在一些情況下，是亞細胞位置。這與傳統測序不同，后者在將樣本從內源環境中移除后分析樣本，從而丟失位置信息。

ISS由斯德哥爾摩大學開發，可同時量化數百個 mRNA 轉錄本，并以單細胞分辨率在空間上解析它們。該方法使用四種熒光染料來指示核酸堿基、 RNA 掛鎖探針和催化在掛鎖探針位置形成環化 DNA 的酶，這種機制稱為滾環擴增。使用成像技術讀取產生的熒光 DNA。

空間檢測技術
斯德哥爾摩大學研究的新的測序方法，稱為原位測序 ( HybISS )。與以前的 ISS 方法一樣，HybISS 使用掛鎖探針的滾環放大。HybISS原位測序除了具有較大的靈活性和多路復用性外，還提高了空間檢測的靈敏度。

HybISS原位測序可用于為細胞圖譜項目創建全面的空間參考地圖。然而，建立完整的器官或組織的完整基因表達譜仍然需要大量時間，這對于研究器官/組織圖譜是必不可少的。



原位測序原理與應用
除了不同類型的腫瘤外，Cartana 已將這種生物技術用于小鼠和人類的至少 12 種組織類型，主要作用是識別組織內的免疫細胞。例如，如果通過這種技術可以繪制和識別腫瘤中的免疫細胞，那么您就可以查看腫瘤的浸潤情況并評估免疫反應的程度，這也是一個熱門應用.

與靶向 ISS 方法相比，熒光原位測序 ( FISSEQ ) 的非靶向方法也被開發應用。生物科學家曾進行過多種不同版本的原位單細胞測序進行開發，包括 RNA、基因組 DNA、病毒 RNA 和條形碼的靶向分析針對蛋白質的抗體。

原位測序技術 和 RNA 結合蛋白
冷泉港實驗室曾使用 INSTA-seq的新方法使用雙向配對末端測序，這種測序方法可以原位讀取單個 cDNA 分子的短分子條形碼。在對細胞或組織進行熒光成像后，再使用 12 個堿基的條形碼來沉淀cDNA 分子，從而在成像中進行基因表達分析，讀取長度超過 300 個堿基。這種原位測序的方法還可以用來檢測 RNA 結合蛋白足跡形式的調控信息，甚至可以在原位以亞細胞分辨率繪制 mRNA 和調控 RNA 結合蛋白之間的相互作用。

綜上所述，由于原位測序原理是在實際生物樣本中通過核苷酸分辨率在單個細胞內精確定位分子機制，這從本質上改變了當前的功能基因組學的研究范疇，所以原位測序ISS的未來 可能會開辟新的分子生物學分支，即：空間功能基因組學。

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