檀香烯是倍半萜類具有代表性的化合物之一，也是檀香精油的主要成分，在醫藥、食品、香料等領域有著重要的應用。由于天然檀香資源十分有限，且難以獲得，合成生物學方法利用微生物細胞工廠大規模生產檀香烯成為解決這一難題的新思路。Establishing Komagataella phaffii as a Cell Factory for Efficient Production of Sesquiterpenoid α-Santalene浙江大學連佳長課題組首次利用畢赤酵母細胞工廠高效合成倍半萜類化合物α-檀香烯。
研究通過優化啟動子，促進了α-檀香烯合成酶基因（SAS） 表達、甲羥戊酸（MVA）途徑關鍵基因的過表達，以及SAS多拷貝整合構建工程菌株。結合培養基和生物工藝優化，后的工程菌株（STE-9）能夠在搖瓶、分批發酵和補料分批發酵中分別生產滴度高達829.8 ± 70.6 mg/L，4.4 ± 0.3 g/L和21.5 ± 1.6 g/L的檀香烯。  
構建產α-檀香烯畢赤酵母株
首先實驗將密碼子優化的α-檀香烯合成酶基因（SAS）引入畢赤酵母中使其能夠生產α-檀香烯。在一系列組成型啟動子和甲醇誘導型啟動子中，TEF1p菌株（STE-1）的α-檀香烯產量更高。以釀酒酵母工程菌株對照進行發酵實驗，證明畢赤酵母在表達外源基因和合成萜類化合物方面具有優勢。
MVA途徑基因過表達和SAS多拷貝整合提高產量
提高MVA途徑的代謝通量是提高萜類化合物產量的有效策略。將tHMG1和IDI1-ERG20整合到STE-1的基因組中，分別獲得工程菌STE-3和STE-5。同時過表達tHMG1和IDI1-ERG20（STE-6）使α-檀香烯的產量增加到246.9 ± 33.8 mg/L，約為STE-1的2.74倍。由于乙酰輔酶A是MVA途徑的直接前體，乙酰輔酶A合成酶基因（ACS*）的過表達使α-檀香烯的產量進一步提高到282.4 ± 44.1 mg/L。

為了進一步提高α-檀香烯的產量，構建了含有SAS多拷貝的畢赤酵母工程菌。將SAS的額外拷貝整合到STE-1、STE-3和STE-7中，獲得工程菌STE-2、STE-4和STE-8，α-檀香烯產量分別是其單拷貝菌株的1.9倍、1.55倍和1.56倍。隨著SAS拷貝數的增加，發現3個拷貝SAS的菌株更為適宜。
 
培養基優化提高產量
進一步通過培養基組分優化提高產物產量。選擇4種不同的蛋白胨測試對α-檀香烯生物合成的影響。搖瓶發酵YP1D組α-檀香烯產量更高，達829.8 ± 70.6 mg/L。YP1D為更適合的培養基組分。
T&J-MInibox 平行生物反應器發酵提高產量
將優化后的工程菌株STE-9用于1-L發酵罐（MInibox，迪必爾生物工程（上海）有限公司）的分批和補料分批發酵對照研究，以便選擇更合適的培養策略。補料分批發酵種，種子被接種至含有600 mL YP1D培養基的發酵罐。發酵溫度控制在30°C，DO 100%，罐體壓力保持在0.8個大氣壓。24 h后，發酵罐中加入10%（v/v）正十二烷。當葡萄糖濃度減少至1 g/L時，進行恒速補料，攪拌速率維持在200-800 rpm，DO約20%。在發酵后期對pH進行調節，并定期測定OD600、葡萄糖濃度、乙醇濃度和產物濃度。
在分批發酵罐中，α-檀香烯的產量為4.4 ± 0.3 g/L，而在補料分批發酵罐中，α-檀香烯的產量高達到21.5 ± 1.6 g/L。補料分批發酵顯著提高產量。該研究利用迪必爾生物反應器成功打破了目前為止報道的α-檀香烯的合成紀錄，證明了合成生物學方法利用畢赤酵母細胞工廠在生產萜類化合物和其他天然珍貴產物上的優勢。

參考文獻：
1、Zuo Y, Xiao F, Gao J, Ye C, Jiang L, Dong C, Lian J. Establishing Komagataella phaffii as a Cell Factory for Efficient Production of Sesquiterpenoid α-Santalene. J Agric Food Chem. 2022 Jun 21. doi: 10.1021/acs.jafc.2c02353. Epub ahead of print. PMID: 35729733.
2、https://mp.weixin.qq.com/s/QHQERgNHVE5LHtkULgkvHA