癌細胞體外培養方法
生物反應器的低剪切應力動態培養測試完成后。



1. 選擇非小細胞肺癌 (NSCLC) 細胞系 Calu-3，并將動態培養的結果與靜態懸浮培養對照進行比較。具體而言，細胞在添加了 10% 胎牛血清 (FBS)、1% 青霉素/鏈霉素 (P/S) 和 1% 非必需品的完全培養基 (DMEM) 中生長氨基酸 (NEAA, Sigma )，并在 37°C 和 5% CO 2的水飽和氣氛中維持在標準細胞培養條件下在空氣中。

2. 在細胞培養瓶中擴增后，將 9x10 6 Calu-3 細胞 (1.92x10 ⁵細胞/mL) 接種在生物反應器培養室內，并在具有完全生長培養基的動態懸浮液中培養 5 天。

3. 生物反應器以 5 mL/min 的流速運行。同時，Calu-3 細胞以相同的密度接種在用作對照的低附著培養瓶（Corning Inc）上，代表靜態懸浮培養模型。

4. 五天后，分別從生物反應器和低附著培養瓶中取出動態和靜態懸浮培養的細胞，并重新懸浮在新鮮的生長培養基中進行進一步分析。進行三個獨立的靜態和動態懸浮培養。
 
細胞體外培養的 驗證
通過倒置顯微鏡（Olympus ）研究從生物反應器和低附著培養瓶中收獲并重新懸浮在新鮮生長培養基中的 Calu-3 細胞。

通過細胞掃描儀和圖像分析軟件收集和分析顯微照片，以便  計算單個 Calu-3 細胞的數量和形成球體的 Calu-3 細胞的數量，以及確定球體尺寸。

細胞的TEM分析
對來自動態和靜態懸浮培養物的 Calu-3 細胞進行了處理，用于透射電子顯微鏡 (TEM) 分析和免疫細胞化學。

TEM 分析步驟如下：將 Calu-3 細胞固定在 Karnovsky 溶液（4% 甲醛、5% 戊二醛）中。樣品在 1% 四氧化鋨中后固定，并通過增加酒精濃度進行脫水。然后，用環氧丙烷洗滌樣品并嵌入環氧樹脂中。用亞甲藍和番紅對 0.5 μm 厚的切片進行染色，以從形態上選擇感興趣的區域。隨后，在 300 目銅網格上收集超薄切片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后，在 TEM下進行定性檢查。

驗證活躍細胞周期中的細胞比例
用抗 Ki67）和抗 γ 組蛋白 H2AX抗體染色細胞斑點，并用 DAB（3,3'-二氨基聯苯胺）顯示過氧化物酶 (HRP) 底物試劑盒反應。Ki67 和 γH2AX 陽性細胞分數的定量驗證是通過計算每個分析樣品上計數的總共 900-2000 個細胞核中的陽性細胞核數來進行的。使用細胞凋亡試劑盒研究單細胞水平的凋亡細胞死亡。使用Olympus BX60或明美顯微鏡測量綠色核熒光陽性。4',6-二脒-2-苯炔醇 。通過計算總共近 1000 個細胞中的凋亡細胞核的數量來驗證死細胞的比例。使用單向方差分析測試分析數據。當 p<0.05 時，結果被認為具有統計學意義。

研究在生物反應器內動態培養 
5天后細胞/球體可能意外粘附在過濾器上，過濾器用4%多聚甲醛固定，在室溫下與DAPI一起孵育15分鐘，依次用熒光顯微鏡觀察驗證其表面是否存在核。
 
驗證培養室下部是否存在粘附的 Calu-3 細胞和沉淀
細胞體外培養收獲時，用細胞刮刀刮擦培養室的內壁，并用磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 洗滌。因此將PBS收集在培養皿中并通過倒置顯微鏡觀察以檢測Calu-3細胞的存在。

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