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qPCR實驗中安全科學地取材操作詳解

瀏覽次數:1365 發布日期:2022-6-10  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

規劃一個qPCR實驗時,最先碰到的問題就是研究目的和材料的選擇。要想做好一個qPCR實驗首先要根據目的選好材料。
 

以目標為導向的取材

研究目標的設立是非常重要的一個起始環節,所以對于樣本取材要求做到兩點,具體準確性和具體代表性。
 

空間異質性

個體的生物變異程度(也可以解讀為生物多樣性)往往是比較高的,這也正是以群體細胞為研究對象的數據往往遭受質疑,而單細胞水平的研究正開展得如火如荼的原因。
 

如何使取到的樣本更具代表性?

首先,提前做好功課,了解樣本的不同分型,或者了解詳細的細胞分群。如果條件允許盡可能覆蓋所有的組織類型或者細胞類型。
 

其次,盡可能增加樣本數量,也就是生物學重復,從而更客觀地反映生物變異程度。一般建議生物學重復的數量至少是10。
 


時間異質性

生物個體的活動會受到生物節律的調控,細胞的轉錄水平也同樣如此。由于轉錄的時間異質性,很多時候會導致qPCR的假陰性結果,如果采樣時間不合適,會導致基因有表達或者表達量很低的錯誤結論。因此采樣時首先要確認采樣時間是否會對最后的結果造成影響,建議做一個比較全面的時間節點研究。


樣本數量

前面建議增加生物學重復,但有時候超過10個的樣本數量并不能保證最后能得到有顯著表達量差異的結果(假如表達有顯著差異是真實存在的),不到10個的樣本數量在表達量差異很大的情況下也是足夠的,這涉及到統計中的power calculation,很多網站提供在線計算,如http://www.univie.ac.at/ medstat等。Power calculation需要提供被比較的兩個組表達量比值、標準差和設定的α和β水平,這樣就可以計算出所需要的最少的樣本數量。表達量比值和標準差等信息往往不能提前預知,需要查閱之前相似實驗的數據,或者通過小規模的實驗來獲得粗略的信息。一般也可通過估算來得到所需的樣本數量,提供一定的參考意義。
 

* power一定的情況檢測不同表達量差異所需的最少樣本數量[3].
 

采樣是需要嚴格規劃的過程,比如材料的時效性、珍貴程度等,都要納入考量范圍。本文討論的幾個因素對qPCR結果的影響是更直接的,需要倍加關注。
 

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圖源:部分圖片來源于網絡,侵刪

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