高效的人群檢測，對主動監控諸如SARS-CoV-2 這樣的病原體的傳播是非常重要的，在降低傳播方面提供了定量數據來支持決策者。在疫情開始的時候，COVID-19 幾乎毫無例外地使用逆轉錄聚合酶鏈式擴增反應（RT-PCR）方法來檢測，但是單純依賴一種技術是有明顯劣勢的。這種在世界范圍對RT-PCR 方法前所未有的需求，導致檢測和其他必要試劑的長期短缺，限制了檢測容量。

與基于PCR 的檢測相比，質譜檢測顯著更加具有特異性，要求一個更寬的視角去處理不同的樣本基質和儀器技術。因此，根特大學（Ghent University）的研究人員發起了一項基于Cov-MS聯盟協作方案，該聯盟已經產生了一個通用的、廣泛適用的基于質譜的分析方案，可以輕松地適應廣泛可變的測試設施環境。
 

---

研究者隨后成立了一個協作聯盟(MS-Cov)，由15 個學術科研和工業實驗室組成，SCIEX等業界主要質譜供應商也在列。研究者利用SCIEX TripleTOF™ 6600+ 系統上采用SWATH^®采集方法獲得的高分辨率質譜儀器數據，創建了一個獨立于質譜儀器供應商的Skyline文檔，其中17個肽段生物標志物來自公開數據中檢測到的兩個SARS-CoV-2結構蛋白，即重組核衣殼蛋白(NCAP_SARS2)和刺突蛋白(SPIKE_SARS2)。向該聯盟的所有成員提供了Skyline文件，以及包含重組NCAP和SPIKE蛋白的樣品試劑盒，以及陰性患者背景下的稀釋系列。15個實驗室共享來自4個不同儀器供應商的數據，這些數據被集中收集，并用于供應商獨立的免費軟件(Skyline)，以評估候選特征肽的最終整體方案性能和適用性，我們建立了Cov-MS數字孵化器，開放的交流和數據共享將有助于將該分析方案轉化為全球不同的臨床環境。所有補充數據均可在Cov-MS數字孵化器中獲得。
    圖3. Cov-MS聯盟報告(紅色，圖片引用自pubs.acs.org/jacsau) 。(A) 優化樣品制備。比較不同的樣本保存培養基、三氯乙酸(TCA)沉淀和15分鐘的消化酶解(n = 5)。LogSumAUC的增加表示為對數轉換。主要集中在三個優化方面：應用不同的酸沉淀策略，即用三氯乙酸(TCA)和鹽酸(HCl)，將消化酶解時間縮短到15分鐘，以及使用不同的保存培養基。雖然這些改變可以提高整體的信號(圖3)，但最好的策略還是通過相關多肽的MRM方法優化和消除離子抑制或通過降低基質干擾以及實驗條件更好。現在可以實現一個少于30分鐘的完整樣品制備工作流程。

(B)不同樣品制備耗材的比較。在標準的工作流程中，肽段在水中溶解并轉移到彈簧內襯管(SI)樣品瓶。使用全回收(QR)小瓶，并在溶劑中加入5%的乙腈(ACN)，可以提高溶劑中大部分肽段的信號，但在UTM中沒有信號提升。底部的欄顯示估計的整體增益歸因于消耗品。
  圖3. Cov-MS聯盟報告(紅色，圖片引用自pubs.acs.org/jacsau) 。 (C)增加eSwab樣品的樣本載樣量。由于eSwabs使用生理鹽水作為保存液，增加柱上樣品的量可能是有益的。因此，我們評估了將載樣量增加5倍的影響，無論是否使用SPE。整體平均LogSumAUC增加2.3倍(虛線)，比如，信號增加了5倍，如果將樣本分成5份，采用SPE策略 。也就是說，如果將5次50 μL的消化液濃縮到一個SPE柱上，至少可以相當于兩個Ct值。自動化處理將使這一發現得到鞏固和擴展，但是我們在這里提醒可能會有SPE過載現象。由于缺乏內部自動化處理方案，我們繼續采用原來的操作過程，50 μL樣品量和10 μL柱上進樣時，不應采用SPE前處理。
  圖3. Cov-MS聯盟報告(紅色，圖片引用自pubs.acs.org/jacsau) 。(D) Cov-MS聯盟內的數據采集。為了簡化所有這些并行實驗方案，研究者為聯盟成員提供了詳細的方法優化標準操作程序(SOP)、包含17個肽段(145 個MRM)的Skyline模板和Cov-MS試劑盒。這些試劑盒含有重組核衣殼蛋白NCAP和刺突蛋白SPIKE的消化液，以及來自健康供體的UTM背景的稀釋液體，一式三份。重要的是，研究表明只有新一代串聯四極桿質譜儀器，能夠達到足夠的靈敏度。此外，匯編數據結果證實了最初的假設，所選肽段是具有實驗特異性的。這些初步結果表明，不同的供應商可以從不同的目標肽段中通過疊加提高靈敏度，即使是相同的MRM。一個突出的例子是RGEPQTQGNFGDQELIR肽，它在SCIEX儀器上特別有效，可能是因為相應的離子源更適合于多電荷的多肽。
 
研究者詳細描述了Cov-MS聯盟為建立一個穩定、靈敏的正交試驗來診確認SARS-CoV-2陽性所做的努力。為了能夠跟蹤每天進行的數百萬次RT-PCR檢測并與之保持一致，科學界的集體努力至關重要，這不僅僅是因為MRM檢測以前很少被用于檢測病毒。   圖5. MRM能力的預測。(A)理論上將Ct與MRM測定方法相關聯的絕對量。在完美的條件下(即質粒)，用內部RT-PCR檢測10 μL樣品中的10個基因組，Ct值為38；在Ct值為40時，檢測2.5個基因組。假設每個病毒粒子攜帶300-350個核衣殼蛋白(NCAP)分子，可以很容易地計算出10 μL中NCAP分子的絕對數量。表中突出顯示的部分 (C) Ct和MRM檢測之間潛在的實際相關性。通過增加32倍的上樣量，富集目標可以產生5倍 Ct值的靈敏度。臨床RT-PCR預期比質粒更高，MRM信號可能因為病毒樣顆粒(VLPs)而更高，這一事實映證這一點。
 
基于液質工作流程的一個主要缺點是，數據采集不能在單個儀器上并行進行，而RT-PCR檢測使用多孔板。然而，使用8分鐘的梯度，一種儀器可以每天測量超過150名患者，通過多通道液相方案，這可以增加到每天500名患者。Cov-MS聯盟的一名成員(Alderley analytics)還研究了2分鐘梯度的應用，并表明當基質相對干凈時，才可行，在沒有并行方案的情況下，每臺儀器每天可增加樣本檢測通量至600名患者。如我們的初步結果所示，在穩定同位素標記和抗肽段抗體俘獲 (SISCAPA)等預先免疫富集的情況下，可以達到低至1分鐘的梯度。至少從樣品制備的角度來看，沒有理由不能使用機器人自動化操作，就像RT-PCR制備一樣。

最近有一項突破性的技術，可以進一步提高產量，那就是聲波激發質譜(AEMS)。SCIEX Echo™ MS系統，納升液滴以每秒三個樣本的速率從樣品中噴射到儀器中，每個液滴可測量4個MRM離子對。這可能會預期每臺儀器每天采樣約30000名患者。

下一期，COVID-19 檢測3」，我們將介紹SCIEX 使用聲波激發質譜開發的肽段定量方法的研究進展。

如果，希望了解更多關于COVID-19質譜檢測方法，SCIEX SWATH® 采集策略，SCIEX Echo™ MS系統，可以掃碼留下您的問題，我們的產品專家會與您溝通。  
參考文獻與信息

1. Cov-MS: A Community-Based Template Assay for Mass-Spectrometry-Based Protein Detection in SARS-CoV-2 Patients, JACS Au Article ASAP (2021); DOI: 10.1021/jacsau.1c00048

2. 獲取有關比利時根特大學的藥物生物技術實驗室的更多信息，請訪問
https://www.ugent.be/fw/pharmaceutics/pharmbiotech/en

3. 您可以在MedRXiv 上了解更多關于這個檢測的更多信息，希望獲得 Cov-MS 數據孵化器，請發送申請郵件至 covms@ugent.be

4. 獲取有關SCIEX TripleTOF™ 系統基于SWATH® 采集策略的更多信息， 請訪問https://sciex.com.cn/technology/swath-acquisition

5. 獲取有關SCIEX Echo™ MS系統的更多信息，請訪問
https://sciex.com.cn/products/integrated-solutions/Echo-ms