COVID-19檢測的質譜解決方案
快速有效的病毒檢測在限制群體病毒傳播上是非常關鍵的，COVID-19 疫情期間對病毒檢測的突發需求，突顯出現代醫學一個巨大的挑戰。根特大學（Ghent University）的研究人員正在開始開發一種基于團體努力為COVID-19 檢測建立的基于質譜的分析方法，為監控通過人群的傳播的新型冠狀病毒SARS-CoV-2 病原體提供了一個可供選擇的方案。
高效的人群檢測，對主動監控諸如SARS-CoV-2 這樣的病原體的傳播是非常重要的，在降低傳播方面提供了定量數據來支持決策者。根據全國新冠病毒核酸檢測信息平臺數據，截至2022年5月11日，全國新冠病毒核酸檢測總檢測能力每日近5700萬管。在疫情開始的時候，COVID-19 幾乎毫無例外地使用逆轉錄聚合酶鏈式擴增反應（RT-PCR）方法來檢測，但是單純依賴一種技術是有明顯劣勢的。這種在世界范圍對RT-PCR 方法前所未有的需求，導致檢測和其他必要試劑的長期短缺，限制了檢測容量。為了緩解實驗室的壓力，我們意識到對于像RT-PCR 這樣有效且通用的一個全新方法的需求。因使用不同的試劑和工作流程，質譜方法完全垂直于其他核酸檢測方法，具有快速有效的病毒檢測，在限制群體病毒傳播上是非常關鍵的， 可以在非常短的時間框內將檢測容量提升一倍的潛力。
盡管RT-PCR這樣的技術檢測效率高、相對簡單、價格低廉，單純依賴一種技術的檢測結果，在靈敏度、假陽性和假陰性診斷方面難以互相驗證。此外，對病毒核酸本身檢測，不能用來直接定義病毒脫落或感染潛力，這突顯出檢測病毒其他生物分子的重要性。與許多其他病毒一樣，SARS-CoV-2可以產生含有高濃度的病毒樣顆粒(VLPs)，這使得VLPs成為基于液相色譜質譜(LC-MS)的檢測和表征的非常有吸引力的研究目標。實際上，基于質譜的蛋白質檢測與傳統的臨床小分子檢測可兼容，并可在幾個小時內適應新的病毒突變。此外，由于質譜檢測沒有擴增步驟，比基于RT-PCR的方法更不易受到污染。
基于SWATH采集策略,
尋找SARS-CoV-2特征生物標志物
根特大學（Ghent University）研究人員建立了一個可供選擇的質譜檢測方法，它能識別COVID-19 感染來源的結構蛋白酶解物，并且由其他實驗室的人員評估了該方法應用的有效性和可靠性。
研究人員基于SWATH® 采集(DIA, 一種SCIEX 的非數據依賴型采集方法)策略，使用靶向in sillico 預測譜庫的在非模式生物中尋找新的生物標志物肽段方法，該方法可以提供寬的分析范圍、特異性和重復性。在SCIEX TripleTOF™ 6600+ 系統上采用SWATH® 采集方法，利用重組核衣殼蛋白（Nucleocapsid，N蛋白）和刺突蛋白（Spike protein，S蛋白）(中國生物科技有限公司，北京，中國)，結合20例患者的鼻咽棉簽樣本，應用最近發布的數據采集和數據分析工作流程機器學習（Machine Learning）訓練預測譜庫，以這種方式發現識別17 個肽段生物標志物。
圖2. 發現階段(藍色，圖片引用自pubs.acs.org/jacsau.) (A) 17個SARS-CoV-2特征肽段生物標志物。根據公開報道數據，我們選擇了兩個靶蛋白(NCAP_SARS2和SPIKE_SARS2)，并獲得了重組的等效蛋白(義翹神州/Sino Biological)。一系列健康志愿者鼻咽拭子250 μL 通用運送培養基稀釋作為本底背景，利用最近發表的工作流程，結合窄窗口數據非依賴型采集（DIA）與預測強度和保留時間，對17個特征肽段進行檢測。箭頭表示重組蛋白序列中的一個取代氨基酸。加粗體序列由最近Grossegesse等人的綜述和參考文獻報道。下劃線序列分別映射到刺突蛋白（SPIKE_SARS2 (S)）、核衣殼蛋白（NCAP_SARS2） C 端結構域和核衣殼蛋白（NCAP_SARS2 ）RNA結合結構域（從左至右）。被映射的肽段在立體結構上被突出顯示，保守性評分標成紅色(0%保守)到藍色(100%保守)。黑色字體序列表示
SARS-CoV病毒的唯一序列。
SWATH 采集數據的優勢，
可以使這些信息簡單快速轉化成
三重四極桿設備的多反應檢測（MRM）方法
這個最初的MRM檢測方案迅速開發出來，并且可以正確地對所有20個盲樣患者樣本進行分類。獲得的質譜數據強度和PCR 方法中獲得的Ct 值具有很強的線性相關性，這初步結果鼓勵研究人員將研究進入下一階段，驗證這個檢測是否可以轉移到其他儀器。
圖2. 發現階段(藍色，圖片引用自pubs.acs.org/jacsau.) (B)基質干擾和肽段選擇。不管肽段的進化保守性如何，所有候選肽段都被保留，進行與基質效應、實驗條件或液質儀器兼容的穩健分析方法的開發。根據樣品保存緩沖液的不同，信號強度和干擾會有很大的變化，如圖所示，在沒有(in-solution)和有樣品保存液eSwab和UTM背景的情況下，保留時間2.5 min時AYNVTQAFGR和DQVILLINK的MRM離子對信號。箭頭表示正確的峰值。虛線內的信號，即，將峰面積相加，計算LogSumAUC值。
圖2. 發現階段(藍色，圖片引用自pubs.acs.org/jacsau.) (C)三種不同樣品保存液背景的強度/載樣量相關性。重組蛋白用于在無基質(in-solution，n = 1)或eSwab(生理鹽水基質，n = 1)或UTM(蛋白基質，n = 3)( 相當于5 μL培養基的柱上量)中評估載樣量。左側嵌入圖說明了保存樣本溶液背景對低強度信號的影響。右側嵌入圖強調了儀器檢測限(LOD)和潛在定量限(LOQ)，和這些病毒蛋白在溶液中的所有MRM離子對兒強度的總和。
圖2. 發現階段(藍色，圖片引用自pubs.acs.org/jacsau.) (D) 質譜蛋白信號與RT-PCR RNA檢測的相關性。從Skyline文件開始，通過MRM離子對選擇，開發了UTM樣品的MRM分析方法。最終的方法由總共包含30個MRM離子對的10個肽段組成。我們對從魯汶大學(Leuven)醫院獲得的20個患者UTM樣本進行了MRM分析。相當于5 μL的培養基樣本的柱上量 (每份樣品3 mL)。利用Skyline軟件進行檢測結果報告，對所有肽段的總AUC (LogSumAUC值)進行對數變換。當與RT-PCR測量的Ct值作圖時，發現有強相關性（可以通過公式將Ct值轉換為預期的質譜信號強度），這表明該質譜檢測方法在臨床上有很大的應用潛力。陰性患者(紅色)的LogSumAUC值都超過X軸上垂直雙線(Ct >40)。
下一期，COVID-19 檢測2」，我們將介紹基于Cov-MS聯盟協作驗證COVID-19 質譜檢測方法的可靠性和有效性。
如果，希望了解更多關于COVID-19質譜檢測方法，SCIEX SWATH® 采集策略，可以掃碼留下您的問題，我們的產品專家會與您溝通。
參考文獻與信息
1. 全國核酸檢測能力每天近5700萬管，國務院聯防聯控機制回應當前疫情熱點問題, 新華社. http://www.gov.cn/xinwen/2022-05/13/content_5690369.htm
2.Cov-MS: A Community-Based Template Assay for Mass-Spectrometry-Based Protein Detection in SARS-CoV-2 Patients, JACS Au Article ASAP (2021); DOI: 10.1021/jacsau.1c00048 ；
3. 獲取有關比利時根特大學的藥物生物技術實驗室的更多信息，請訪問https://www.ugent.be/fw/pharmaceutics/pharmbiotech/en
4. 您可以在MedRXiv 上了解更多關于這個檢測的更多信息，希望獲得 Cov-MS 數據孵化器，請發送申請郵件至 covms@ugent.be
5. 獲取有關SCIEX TripleTOF™ 系統基于SWATH® 采集策略的更多信息， 請訪問https://sciex.com/technology/swath-acquisition
高效的人群檢測，對主動監控諸如SARS-CoV-2 這樣的病原體的傳播是非常重要的，在降低傳播方面提供了定量數據來支持決策者。根據全國新冠病毒核酸檢測信息平臺數據，截至2022年5月11日，全國新冠病毒核酸檢測總檢測能力每日近5700萬管。在疫情開始的時候，COVID-19 幾乎毫無例外地使用逆轉錄聚合酶鏈式擴增反應（RT-PCR）方法來檢測，但是單純依賴一種技術是有明顯劣勢的。這種在世界范圍對RT-PCR 方法前所未有的需求，導致檢測和其他必要試劑的長期短缺，限制了檢測容量。為了緩解實驗室的壓力，我們意識到對于像RT-PCR 這樣有效且通用的一個全新方法的需求。因使用不同的試劑和工作流程，質譜方法完全垂直于其他核酸檢測方法，具有快速有效的病毒檢測，在限制群體病毒傳播上是非常關鍵的， 可以在非常短的時間框內將檢測容量提升一倍的潛力。
盡管RT-PCR這樣的技術檢測效率高、相對簡單、價格低廉，單純依賴一種技術的檢測結果，在靈敏度、假陽性和假陰性診斷方面難以互相驗證。此外，對病毒核酸本身檢測，不能用來直接定義病毒脫落或感染潛力，這突顯出檢測病毒其他生物分子的重要性。與許多其他病毒一樣，SARS-CoV-2可以產生含有高濃度的病毒樣顆粒(VLPs)，這使得VLPs成為基于液相色譜質譜(LC-MS)的檢測和表征的非常有吸引力的研究目標。實際上，基于質譜的蛋白質檢測與傳統的臨床小分子檢測可兼容，并可在幾個小時內適應新的病毒突變。此外，由于質譜檢測沒有擴增步驟，比基于RT-PCR的方法更不易受到污染。
基于SWATH采集策略,
尋找SARS-CoV-2特征生物標志物
根特大學（Ghent University）研究人員建立了一個可供選擇的質譜檢測方法，它能識別COVID-19 感染來源的結構蛋白酶解物，并且由其他實驗室的人員評估了該方法應用的有效性和可靠性。
研究人員基于SWATH® 采集(DIA, 一種SCIEX 的非數據依賴型采集方法)策略，使用靶向in sillico 預測譜庫的在非模式生物中尋找新的生物標志物肽段方法，該方法可以提供寬的分析范圍、特異性和重復性。在SCIEX TripleTOF™ 6600+ 系統上采用SWATH® 采集方法，利用重組核衣殼蛋白（Nucleocapsid，N蛋白）和刺突蛋白（Spike protein，S蛋白）(中國生物科技有限公司，北京，中國)，結合20例患者的鼻咽棉簽樣本，應用最近發布的數據采集和數據分析工作流程機器學習（Machine Learning）訓練預測譜庫，以這種方式發現識別17 個肽段生物標志物。
圖2. 發現階段(藍色，圖片引用自pubs.acs.org/jacsau.) (A) 17個SARS-CoV-2特征肽段生物標志物。根據公開報道數據，我們選擇了兩個靶蛋白(NCAP_SARS2和SPIKE_SARS2)，并獲得了重組的等效蛋白(義翹神州/Sino Biological)。一系列健康志愿者鼻咽拭子250 μL 通用運送培養基稀釋作為本底背景，利用最近發表的工作流程，結合窄窗口數據非依賴型采集（DIA）與預測強度和保留時間，對17個特征肽段進行檢測。箭頭表示重組蛋白序列中的一個取代氨基酸。加粗體序列由最近Grossegesse等人的綜述和參考文獻報道。下劃線序列分別映射到刺突蛋白（SPIKE_SARS2 (S)）、核衣殼蛋白（NCAP_SARS2） C 端結構域和核衣殼蛋白（NCAP_SARS2 ）RNA結合結構域（從左至右）。被映射的肽段在立體結構上被突出顯示，保守性評分標成紅色(0%保守)到藍色(100%保守)。黑色字體序列表示SARS-CoV病毒的唯一序列。
SWATH 采集數據的優勢，
可以使這些信息簡單快速轉化成
三重四極桿設備的多反應檢測（MRM）方法
這個最初的MRM檢測方案迅速開發出來，并且可以正確地對所有20個盲樣患者樣本進行分類。獲得的質譜數據強度和PCR 方法中獲得的Ct 值具有很強的線性相關性，這初步結果鼓勵研究人員將研究進入下一階段，驗證這個檢測是否可以轉移到其他儀器。
圖2. 發現階段(藍色，圖片引用自pubs.acs.org/jacsau.) (B)基質干擾和肽段選擇。不管肽段的進化保守性如何，所有候選肽段都被保留，進行與基質效應、實驗條件或液質儀器兼容的穩健分析方法的開發。根據樣品保存緩沖液的不同，信號強度和干擾會有很大的變化，如圖所示，在沒有(in-solution)和有樣品保存液eSwab和UTM背景的情況下，保留時間2.5 min時AYNVTQAFGR和DQVILLINK的MRM離子對信號。箭頭表示正確的峰值。虛線內的信號，即，將峰面積相加，計算LogSumAUC值。下一期，COVID-19 檢測2」，我們將介紹基于Cov-MS聯盟協作驗證COVID-19 質譜檢測方法的可靠性和有效性。
如果，希望了解更多關于COVID-19質譜檢測方法，SCIEX SWATH® 采集策略，可以掃碼留下您的問題，我們的產品專家會與您溝通。
1. 全國核酸檢測能力每天近5700萬管，國務院聯防聯控機制回應當前疫情熱點問題, 新華社. http://www.gov.cn/xinwen/2022-05/13/content_5690369.htm
2.Cov-MS: A Community-Based Template Assay for Mass-Spectrometry-Based Protein Detection in SARS-CoV-2 Patients, JACS Au Article ASAP (2021); DOI: 10.1021/jacsau.1c00048 ；
3. 獲取有關比利時根特大學的藥物生物技術實驗室的更多信息，請訪問https://www.ugent.be/fw/pharmaceutics/pharmbiotech/en
4. 您可以在MedRXiv 上了解更多關于這個檢測的更多信息，希望獲得 Cov-MS 數據孵化器，請發送申請郵件至 covms@ugent.be
5. 獲取有關SCIEX TripleTOF™ 系統基于SWATH® 采集策略的更多信息， 請訪問https://sciex.com/technology/swath-acquisition
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