一般會有污染、細胞計數、生長緩慢、生長過快、貼壁細胞不貼壁、懸浮細胞死細胞多等情況。

                                                                   細胞污染

       首先呢，細胞污染是細胞培養過程中最常見也是讓大家最頭疼的一件事情，因為他會對我們的實驗甚至于細胞產生十分嚴重的后果。所以，我們首先做的就是我們所使用的超凈臺的維護和清潔，使用前后要用75%酒精進行清潔,消毒。再有就是槍頭和固體垃圾在超凈臺內的放置，也是需要注意的一點，要避免他們成為污染源。此外UV殺菌也是實驗前必要的手段。

為防止污染實驗前準備

      細菌污染是比較常見的細胞污染之一，一般我們會鏡下可看到黑色的到處亂跑的黑點。細胞一旦出現細菌污染，爆發會很快，培養基很快就會出現渾濁，且他們會很快的抑制正常細胞的生長，使其狀態變差。這個時期，細胞培養液會變得粘稠， 且會產生一些異味。（給大家推薦一下中喬新舟支青霉素- 鏈霉素混合溶液雙抗）

 

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另一個讓大家比較頭疼的是真菌污染，下圖是一個酵母污染的細胞：

 

 

此時給大家的建議是，實驗過程中，一定要和使用過酵母實驗的超凈臺分開始用，真菌污染是很難清除的，一般只要被污染，細胞基本就要廢棄了，真菌細胞會產生孢子，我們雙抗之類的試劑也很難有效的殺死這些孢子，他們會在有害的條件下休眠，等條件適合了，會進行增殖，所以有時候這個污染會出現延遲性爆發現象。

 

      另一點是大家比較頭疼的是支原體污染了，據調查顯示，亞洲是支原體污染概率出現最高的地區。

      怎么很好的觀察到支原體污染呢？一般情況下某些細胞在熒光顯微鏡的明場下，能看到一些細胞有一些絲絲拉拉的拖影。

 

 

此外呢，我們也可以購買一些支原體抑制劑試劑盒。（給大家推薦一下中喬新舟支原體清除劑升級版）

 

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進行提前的預防，另外就是我們操作上要多多注意一下細節，最后就是要保證我們的實驗的環境。

 

細胞計數問題

           

      計數規則是計上不計下，計左不計右，取混合均勻的10ul母液，計算紅色小格內數量平均數然后乘上10的4次方，就是每毫升細胞數量。

 

細胞生長緩慢

       遇到細胞生長緩慢的情況，采取的措施有：一是換一管或者其他批次的細胞進行培養，所以細胞要盡量多保存不同批次的細胞，二是可以相應的提高血清濃度（特殊的對血清敏感的細胞除外），一般15-20%即可，再高的的血清濃度反而不好，意義不大反而影響里面的營養成分。三是細胞密度也要多多注意，一般保持在1~5X105/ML，且保持新鮮的培養基，讓細胞盡量獲得好的營養。有些細胞生長緩慢，是需要特定的生長因子，如EGF、VEGF、GFG、IGF等等

 

生長過快

       首先要懷疑是不是污染了，如果不是，就是我們接種密度要適當降低，或者使用更大的培養器皿去培養，或者適當的降低血清濃度。

 

貼壁細胞不貼壁

      貼壁細胞貼壁不牢固，可能是貼壁時間不夠，細胞不能充分的依附于細胞培養皿表面，可以在接種前離心培養，細胞貼壁牢固之后再換液培養。另一點可能是細胞本身的吸附力不夠，此時我們需要對培養皿進行特殊的處理，以提高細胞的貼壁能力，可以使用包被液，如多聚賴氨酸、牛血漿纖維粘連蛋白、明膠、基質膠等等。（給大家推薦一下中喬新舟多聚賴氨酸）

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懸浮細胞碎片多

       對于懸浮細胞出現很多細胞碎片的情況，死細胞的碎片會對其他生長良好的細胞產生影響，但是通過簡單的離心又很難去除掉這些有害的細胞碎片。此時，我們一般使用Ficoll進行密度梯度離心進行分離。細胞離心后PBS懸液輕輕加入含有Ficoll的上層，離心機升降速調至最低，1500轉離心10~20min左右，死細胞碎片會積聚在離心管底部，活細胞在整個液體中間層，為一層白色透明帶，用移液器輕輕吸出中間層白色透明條帶，稀釋離心即可（此方法來自PBMC的分離經驗）。（給大家推薦一下中喬新舟PBS磷酸鹽緩沖液）

 

 

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