血液組成及血液基因組提取方法的介紹
背景：
隨著分子生物學技術的發展，基因組學研究已成為熱點。在分子遺傳學和分子流行病學中，無論是全基因組關聯分析GWAS（Genome-Wide Association Studies）、候選SNP（Single Nucleotide Polymorphism）位點基因分型，還是基因組文庫的建立，都需要從大批量血液樣本中提取基因組DNA。因此，如何能夠從高通量血液樣本中提取足量的高質量、高純度DNA便成為下游實驗的基本前提。
為了提取獲得高質量、高純度血液基因組DNA，首先讓我們需要了解一下血液的組成。
圖源：
https://www.khanacademy.org/science/biology/humanbiology/circulatorypulmonary/a/components-of-the-blood
1.血液的組成
血液是動物體內的一種體液，可向細胞輸送必要的物質，如營養和氧氣，并將代謝廢物從這些細胞中運走。血液的主要組成包括：血漿（液體部分，含有水、蛋白質、鹽、脂質和葡萄糖）、紅細胞、白細胞和血小板。
https://courses.lumenlearning.com/boundless-biology/chapter/components-of-the-blood/
人體血液的細胞和細胞成分：紅細胞向細胞輸送氧氣并去除二氧化碳。白細胞（包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞）參與免疫反應。血小板形成凝塊，防止受傷后失血。
a.血漿：
血漿是去除所有細胞和血小板后的血液液體成分，約占總血量的 55%。血漿由 90% 的水和抗體、凝血因子以及維持身體所需的電解質、脂質和蛋白質組成。
b.紅細胞：
紅細胞（Red blood cells或erythrocytes，erythro- = “紅色”；-cyte = “細胞”）是一種通過身體循環向其他細胞輸送氧氣的特殊細胞，由骨髓中的干細胞形成，約占總血量的 45%。在哺乳動物中，紅細胞是小的雙凹細胞，成熟時不含細胞核或線粒體。它們的大小只有 7–8 µm。在鳥類和非鳥類爬行動物中，紅細胞含有一個細胞核。
紅細胞的顏色來自含鐵血紅蛋白，在大多數哺乳動物中，紅細胞沒有任何細胞器（例如細胞核、線粒體）。無脊椎動物使用不同的色素來結合和攜帶氧氣。例如血藍蛋白（一種藍綠色、含銅的蛋白質）、氯紅素（一種綠色、含鐵的色素）和蚯蚓血紅蛋白（一種紅色、含鐵的蛋白質）。
圖源：
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a.血紅蛋白 b. 血藍蛋白 c. 蚯蚓血紅蛋白
c.白細胞：
白細胞（White blood cells或 leukocytes，leuko = 白色）約占總血量不到 1%。白細胞的作用與紅細胞的作用非常不同。它們主要參與識別和靶向病原體的免疫反應，例如入侵的細菌、病毒和其他外來生物。
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白細胞的類型：(a) 粒性細胞（中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞）的特征在于細胞質中的葉狀核和粒狀包涵體。粒細胞通常是受傷或感染期間的第一反應者。(b) 無粒細胞包括單核細胞和淋巴細胞。單核細胞分化成巨噬細胞和樹突狀細胞，進而對感染或損傷作出反應。淋巴細胞，包括 B 細胞和 T 細胞，負責適應性免疫反應。
d.血小板：
血小板是由稱為巨核細胞的較大細胞分解形成的。對于每個巨核細胞，形成 2000-3000 個血小板，每立方毫米血液中存在 150,000 至 400,000 個血小板。每個血小板呈圓盤狀，直徑為 2-4 μm，它們包含許多小囊泡，但不包含細胞核。
(a) 血小板是由稱為巨核細胞的大細胞形成的。巨核細胞分裂成數千個碎片，成為血小板。(b) 血小板與其他凝血因子（例如纖維蛋白原）一起聚集在傷口部位，形成纖維蛋白凝塊，防止失血并使傷口愈合。
2.血液基因組提取方法
a.鹽析方法:
經典鹽析法提取血液DNA，其方法為溶解紅細胞后，離心沉渣用PK消化，用大約6M飽和NaCl沉淀蛋白質，離心上清中DNA用無水乙醇沉淀，用TE溶解。此方法提取的DNA質量尚可，但產率較低，并且純度較差。
b.有機溶劑方法:
有機法提取DNA一般是指用平衡酚(又叫飽和酚)、氯仿等按不同比例混合，采用不同方法提取DNA。此方法操作繁瑣，耗時久，且所用試劑具有一定的毒性。
c.柱法（硅膜法）：
特殊硅基質材料在一定的高鹽緩沖系統下高效、專一地吸附DNA（低鹽、高pH值情況下釋放DNA），配備設計獨特的離心吸附柱式結構，使用常規臺式高速離心機，在30-60min之內即可以高效回收核酸片段。此方法操作簡便，但依賴人工操作，很難實現自動化。
d.磁珠法：
異硫氰酸胍是強烈蛋白變性劑，不破壞蛋白質一級結構，能破壞細胞膜及核膜蛋白，并使核酸酶失活，釋放DNA。磁珠可以特異性吸附DNA，通過洗滌液洗滌，在僅留有特異吸附DNA的磁珠中加入洗脫液，DNA釋放于洗脫液中。此方法自動化程度高，可滿足高通量提取的需求，是未來核酸提取的發展方向。
3.濟凡磁珠法大體積血液核酸提取
近些年，隨著醫院和第三方獨立醫學實驗室等醫療機構建立DNA樣本庫的需求越來越廣泛，1～4mL大體積全血DNA提取的工作量迅速增加，傳統的手動操作方案已經不能滿足建立大量血液DNA樣本庫的要求，可實現大體積全血DNA的高通量快速自動提取的工作站已經成為大勢所趨。
目前市面上大體積全血樣本DNA提取產品多采用裂解紅細胞前處理+離心吸附柱方法從全血樣本中分離純化DNA，但此方法存在操作繁瑣、通量小和耗時長的不足。由濟凡生物研發的新型血液核酸提取試劑，搭配24通道自動核酸提取儀可實現大體積血液樣本核酸分離純化。新方案無紅細胞裂解前處理，只需將血液樣本加入裝有裂解液的24孔預分裝板后，交由24通道自動核酸提取儀去完成；本方案一次可提取24個樣本，整個過程在2小時內便可完成。
示例：濟凡磁珠法大體積血液樣本DNA分離純化方案，提取2 mL全血樣本（300 μL 洗脫）
由圖示結果可知：濟凡磁珠法大體積血液DNA分離純化方案提取2 mL全血樣本基因組DNA，DNA得率為70~78 μg，A260/A280比值為1.8~2.0，A260/A230比值為1.8~2.0。
參考文獻：
1.Components of the Blood
https://courses.lumenlearning.com/boundless-biology/chapter/components-of-the-blood/
2.Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1988 Feb 11;16(3):1215. doi: 10.1093/nar/16.3.1215. PMID: 3344216; PMCID: PMC334765.
3.Buedts L, Smits S, Ameye G, Lehnert S, Ding J, Delforge M, Vermeesch J, Boeckx N, Tousseyn T, Michaux L, Vandenberghe P, Dewaele B. Ultra-low depth sequencing of plasma cell DNA for the detection of copy number aberrations in multiple myeloma. Genes Chromosomes Cancer. 2020 Aug;59(8):465-471. doi: 10.1002/gcc.22848. Epub 2020 May 5. PMID: 32259320.
