在ELISA試劑盒中一般有兩次抗原抗體反響，即加標本和加酶結合物后。抗原抗體反響的完結需求有必定的溫度和時刻，這一保溫進程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育。
溫育時刻：
ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發作。以抗體包被的夾心法為例，參加板孔中的標本，其間的抗原并不是都有平等的和固相抗結合的時機，只需最靠近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐漸平衡的進程，因而需經擴散才干到達反響的結尾。在這以后參加的酶符號抗體與固相抗原的結合也相同如此。這就是為什么ELISA反響總是需求必定時刻的溫育。

溫育溫度：
溫育常選用的溫度有43℃、37℃、室溫文4℃(冰箱溫度)等。37℃是試驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的適宜溫度。在樹立ELISA辦法作反響動力學研討時，試驗標明，兩次抗原抗體反響一般在37℃經1-2小時，產物的生成可達頂峰。為加速反響，可進步反響的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜選用更高的溫度。抗原抗體反響4℃更為完全，在放射免疫測定中多使反響在冰箱中過夜，以構成最多的沉積。但因所需時刻太長，在ELISA中一般不予選用。

溫育保溫：
保溫的方法除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均選用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應貼著水面，使溫度敏捷平衡。為防止蒸騰，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此刻可讓反響板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性杰出的資料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最終將試劑盒板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規則的溫度，特別是在氣溫較低的時分更應如此。無論是水浴仍是濕盒溫育，反響板均不宜疊放，以確保各板的溫度都能敏捷平衡。室溫溫育的反響，操作時的室溫應嚴厲約束在規則的范圍內，規范室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據說明書的要求操控溫育。室溫溫育時，ELISA板只需平置于操作臺上即可。