中喬新舟
 
做細胞培養(yǎng)的時候，對于剛開始接觸細胞培養(yǎng)的同學來說，最怕的就是細胞受污染。以下是細胞主要污染的八個源頭以及分辨細胞是否污染和防治一些細胞污染的方法，僅供參考。
細胞污染認定：凡混入細胞培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物都應(yīng)視為污染，細胞污染不能完全被消除，但能減少其發(fā)生的頻率和后果的嚴重性。細胞污染根據(jù)污染源主要可以分為物理性，化學性和生物性污染。
 
                                                   01細胞物理性污染預(yù)防措施
 
 
 
物理性污染常常被人們所忽視或被籠統(tǒng)地歸為化學性污染。物理性污染通過影響細胞培養(yǎng)體系中的生化成分，從而影響細胞的代謝。培養(yǎng)環(huán)境中的物理因素，如溫度、放射線、振動、輻射(紫外線或熒光)會對細胞產(chǎn)生影響。細胞、培養(yǎng)液或其它培養(yǎng)試劑暴露于放射線、輻射或過冷過熱的溫度中，可以引起細胞代謝發(fā)生改變，如細胞同步化、細胞生長受抑制甚至細胞死亡。通過實驗室的合理設(shè)計及建立規(guī)范的操作規(guī)程，可以減少環(huán)境中物理因素對細胞的影響。孵箱應(yīng)放在溫度較恒定的環(huán)境中，周圍不能放置能引起機械振動的設(shè)備，如離心機。培養(yǎng)液及培養(yǎng)試劑應(yīng)放在固定的位置，為避免光照試劑不能放在玻璃門的冰箱中，試劑周圍不能放同位素。培養(yǎng)液從冰箱中取出后應(yīng)在室溫中放置一段時間后再進行實驗，以避免過冷的溫度對細胞的影響。
 
                                                      02化學性污染防治手法
 
 
培養(yǎng)環(huán)境中許多化學物質(zhì)都可以引起細胞的污染。化學物質(zhì)并不總是抑制細胞的生長，某些化學物質(zhì)如激素就可促進細胞的生長。不同細胞對化學物質(zhì)污染的反應(yīng)是不一樣的。未純化的物質(zhì)、試劑、水、血清、生長輔助因子及儲存試劑的容器都可能成為化學性污染的來源。細胞培養(yǎng)的必需養(yǎng)分，如氨基酸，若濃度超過了合適的范圍，也會對細胞產(chǎn)生毒性。同樣，不同細胞系其最佳培養(yǎng)條件下對血清和緩沖液的要求是不一樣的，在培養(yǎng)中應(yīng)嚴格控制。玻璃制品清洗過程中殘留的變性劑或肥皂(通常殘留在瓶蓋的內(nèi)表面)是最常見的化學性污染。水是唯一一種在凝固時膨脹的化合物。因此在選擇凍存細胞的容器時應(yīng)考慮到這個因素。容器因水的膨脹而發(fā)生破裂是引起試劑污染的重要原因。為了避免金屬離子、有機分子、細胞內(nèi)毒素等物質(zhì)對水的污染，在配制液體，清洗容器時必須使用不含雜質(zhì)的超純水。需要注意的是，超純水放置過久其純度會下降。在高壓蒸氣滅菌及蒸餾水時水經(jīng)常被污染，因為高壓蒸氣鍋及純水機的常規(guī)維護后可能有少量的化學物質(zhì)殘留。為了保證水的純度，我們應(yīng)采取措施盡量避免化學物質(zhì)的殘留。動物血清是細胞培養(yǎng)中常用的天然培養(yǎng)基，但血清又是潛在的生物及化學污染的來源。由于血清采集于多個動物，而且不同廠商的生產(chǎn)工藝及質(zhì)量各不相同，因此血清中許多成分的濃度存在很大的變異。血清對不同細胞的促生長能力及毒副作用取決于這些細胞的分化功能、組織來源及培養(yǎng)基的成分等因素。在進行一系列實驗時，為了保證實驗的可重復性，最好選用同一批次的血清。培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑　培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑都可能成為化學性污染的來源。細胞培養(yǎng)使用的所有物質(zhì)都應(yīng)是高純度的，并經(jīng)過權(quán)威機構(gòu)的鑒定，實驗者本人也應(yīng)對上述成分進行純度鑒定。同時，正確配置和儲存培養(yǎng)液及試劑也是非常重要的，應(yīng)該采取標準的操作步驟，避免液體體積計算錯誤，混用類似化合物等錯誤。培養(yǎng)器皿及容器　細胞培養(yǎng)過程中會使用到各種不同的培養(yǎng)器皿及容器。培養(yǎng)器皿的大小，構(gòu)形設(shè)計可能會影響到培養(yǎng)中氣體交換、濕度、培養(yǎng)液的pH值和細胞生長密度。培養(yǎng)器皿的工藝及滅菌過程中的差異可能對培養(yǎng)體系產(chǎn)生影響。塑料制品在生產(chǎn)過程中可能殘留一些有毒成形劑，生產(chǎn)工藝的不同可能引起器皿表面附著能力的不同。儲存不同物質(zhì)時應(yīng)選用合適的塑料或玻璃容器，因為酒精、強酸、強堿能夠溶解塑料或玻璃的某些成分。
 
                                                     03不可不預(yù)防的微生物污染
 
 
由于體外培養(yǎng)的細胞自身沒有抵抗污染的能力，而在培養(yǎng)基中加抗生素的抗污染能力也是有限的，因而細胞微生物污染一旦發(fā)生往往是無法挽救的。一般在細胞受到污染早期或污染較輕時，能及時處理并除去污染物，部分細胞還有可能得到挽救。但當細胞持續(xù)在污染環(huán)境中生長時，輕者細胞生長緩慢，分裂相減少，細胞變得粗糙，輪廓增強，胞漿中出現(xiàn)較多的顆粒物質(zhì)；較重的細胞增殖停止，分裂相消失，細胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細胞變圓或崩解，從瓶壁脫落。不同的微生物污染物對細胞的影響也有差別，微生物中支原體和病毒對細胞形態(tài)和技能的影響是長期的，緩慢的和潛在的。而霉菌和細菌增殖迅速，能在很短的時間內(nèi)抑制細胞生長或產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺滅細胞。
 
                                                   04霉菌污染的防治秘訣
 
         
    此種污染表現(xiàn)：真菌的種類很多，污染的多是曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成淡黃色或是白色的漂浮物，一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不變混濁。倒置顯微鏡下可以看見細胞之間有縱橫交錯穿行的絲狀，樹枝狀或管狀菌絲，并漂浮在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡下可以看見鏈狀排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圓形，散在細胞上及細胞周邊生長。有時通過顯微鏡可能會發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)瓶外壁生長的菌絲，較易誤認為污染。發(fā)現(xiàn)瓶外的菌絲后應(yīng)及時用酒精擦拭干凈。
       處理：首先，需確定污染物是細菌、真菌、支原體，還是酵母。現(xiàn)在你確認是霉菌污染。因此，盡快把污染細胞與其它細胞系隔離開，同時需要對實驗過程中所用的器材和試劑做處理。
      一般來說，高濃度的抗生素和抗霉菌素都可能對細胞或細胞系有毒性作用，因而，做劑量反應(yīng)實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。
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下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。

1)在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細胞，稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度。
2)分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3)每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。
4)確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2－3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2－3代。
5)在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代。
6)重復步驟4。
7)在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4－6代，確定污染
 

                                                    05預(yù)防細菌污染有妙招

       細菌污染較常見的有大腸桿菌，白色葡萄球菌，假單孢菌等。加用抗菌素的培養(yǎng)液可預(yù)防和排除個別一般少量細菌的污染。一旦發(fā)生細菌污染很容易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短時間內(nèi)變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，出現(xiàn)明顯渾濁現(xiàn)象；有時靜置的培養(yǎng)液起初不混，但稍加震蕩，就有許多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時在細胞表面及周圍有大量細菌存在，細胞停止生長并有中毒表現(xiàn)。必要時可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以明確細菌種類；有的培養(yǎng)液改變不明顯而有疑似污染，亦可向肉湯培養(yǎng)基內(nèi)滴入少量培養(yǎng)液，37度培養(yǎng)以檢測。處理：一般用抗生素的常用量的5~10倍作沖擊療法，用藥24~48小時后再換常規(guī)培養(yǎng)液，有時在早期污染時此法有效。細胞培養(yǎng)中用抗生素多為預(yù)防細菌污染，一半多聯(lián)合應(yīng)用。一旦發(fā)生污染后再使用抗生素常常難以根除，有的抗生素只有抑菌作用而無殺菌效應(yīng)。

 

 

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  06預(yù)防有道，支原體也會被打倒

 

        

  支原體是一種大小介于細菌和病毒之間(最小直徑0．2um)并獨立生活的微生物．約有1%可通過濾菌器。支原體無細胞壁形態(tài)呈高度多形性．可為圓形、絲狀或梨形。      支原體形態(tài)多變，在光境下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。電鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)．其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細胞表面和細胞之間。橫斷面與細胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無顆粒群或中央束。     支原體代謝需固醇類物質(zhì)、部分種類需要精氨酸、O 2或葡萄糖，每一種支原體都有自身持點。多數(shù)支原體適合于偏堿條件下生存(PH7．6—8．0)，對酸耐受性差。對熱比較敏感，對一般抗生素不敏感。      支原體污染細胞后．培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁．多數(shù)情況下細胞病理變化輕微或不顯著，細微變化也可由于傳代、換液而緩解．因此易被忽視。但個別嚴重者，可致細胞增殖緩慢．甚至從培養(yǎng)器皿脫落。

 

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為確定有無支原體污染可做如下檢酗：                                                                        

①相差顯微境檢測：將細胞按種于事先放置于培養(yǎng)瓶內(nèi)的蓋玻片上，24h后取出，用相差油鏡觀察．支原體呈暗色微小顆粒位于細胞表面和細胞之間。② 熒光染色法：熒光染色用能與DNA特異性結(jié)合的熒光染料Hoechst 33258，可使支原體內(nèi)含有的DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀察。具體方法如下：首先將細胞接種蓋玻片上，在細胞未長滿前取出玻片，用不合酚紅的 Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理鹽水漂洗．置于用生理鹽水配濃度為50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min．向細胞面滴加pH5．5磷酸緩沖液數(shù)滴，然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下支原體為散在于細胞同圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點。③電鏡檢查；用掃描電鏡方法簡便快速．也可以利用透射電鏡。④DNA分子條文檢查或支原體培養(yǎng)等方法：檢出率高．但方法較為復雜                                                                                               
處理                                                                                                                                          
（1）  加溫：根據(jù)支原體對熱敏感的特點，將受支原體污染的細胞放在41度作用4~5小時，最長不超過18小時，以殺滅支原體。但如此高的溫度對細胞生長本身也有影響，因而在實驗前先用少量細胞膜所最適合的溫度和時間，以盡可能保證殺滅支原體而細胞本身又不受損傷。（2）  動物體內(nèi)接種：將受支原體污染的細胞接種在同種動物的皮下或腹腔，借體內(nèi)的免疫系統(tǒng)殺滅支原體。待一定時間后，取出做原代培養(yǎng)再繁殖。                                                                                               
 
    07怎樣殺滅黑膠蟲-細胞的災(zāi)星
 
     
  “黑膠蟲”在細胞培養(yǎng)中是一個令人頭痛的問題，盡管剛開始做細胞培養(yǎng)，但在自己培養(yǎng)的細胞中也出現(xiàn)過“小黑點”，在高倍鏡下似乎能看見其有不規(guī)則的運動，并且其生長與細胞的生長有此消彼長的關(guān)系，即當細胞狀態(tài)好時小黑點會相應(yīng)的減少；反之則增加，似乎有細胞競爭生長的關(guān)系，但總的來說它的出現(xiàn)并不影響細胞的生長。細胞經(jīng)過每天換液，PBS沖洗，細胞中的小黑點逐漸減少，最終消失（在之后的換液傳代中，偶爾會在鏡下看見個別的小黑點）。在此過程中我們也看了一些關(guān)于“黑膠蟲”的資料，發(fā)現(xiàn)其實它是實驗室中普遍存在的一個問題，國內(nèi)外對“黑膠蟲”并沒有一個明確的定義。其實更加偏向于不存在所謂的“黑膠蟲”問題。首先小黑點并不影響細胞的貼壁生長，這是與大部分微生物污染不同。其次，培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的小黑點只是狀態(tài)差的細胞發(fā)生死亡后形成的，可能是一個凋亡小體，也肯能是細胞碎片。當細胞狀態(tài)好時，這些小黑點就會減少。第三，當顆粒的直徑足夠小，在液體中作不規(guī)則布朗運動也是正常的。                            
 
  08預(yù)防細胞的交叉污染守則
 
      
   細胞污染和細菌污染不同，細胞污染是由于在培養(yǎng)過程中各種細胞同時進行，而所用器具或液體混雜使用所致。這種污染沒有微生物存在，但使培養(yǎng)細胞不同種類之間發(fā)生混亂，細胞生長特性，形態(tài)發(fā)生變化。有些變化輕微，不易察覺，有些則可能由于污染的細胞具有生長優(yōu)勢而最終壓過原來細胞而導致細胞生長的抑制，最終死亡。污染過的細胞由于種類不純，無法進行實驗研究。     防治及處理：（1）在進行多個種類細胞培養(yǎng)操作時，所有器具要嚴格區(qū)分，最好作上標記以區(qū)分。對每一種細胞按順序進行操作，避免一起操作時造成的混亂。（2）進行換液或傳代操作時，注射器或滴管不要接觸培養(yǎng)瓶瓶口，避免把細胞帶到培養(yǎng)液瓶中。在進行其他細胞操作時導致細胞污染。（3）所有從別處轉(zhuǎn)來的或是自己所建的細胞系都要早期留有的充足的凍存儲備，一旦懷疑發(fā)生交叉污染，可做細胞遺傳學方面的鑒定，如發(fā)現(xiàn)原有的細胞遺傳物發(fā)生改變，可以復蘇早期凍存的細胞使用。