眾所周知，機械負荷可以改善肌腱愈合。承受負荷的愈合肌腱會變得強壯幾倍，但其內在機制尚不完全清楚。
 

細胞之間的分泌組串擾會誘導多種功能，例如細胞增殖、遷移、膠原蛋白生成和細胞分化。來自機械加載的肌肉細胞的分泌組已被證明含有增加水平的生長因子，如成纖維細胞生長因子 (FGF)，它可能與肌腱細胞表達的受體結合以改善愈合過程。這些表明肌肉分泌組可能會改善肌腱愈合。
 

已知機械負荷的臨床變化對肌腱愈合有不同的影響。然而，不同的負荷方案是否會影響肌細胞分泌組，從而導致肌腱愈合的不同結果尚不清楚。
 

肌腱愈合過程包括三個重疊階段：炎癥、增殖和重塑。有研究發現大鼠骨髓間充質干細胞的分泌因子增強肌腱細胞的遷移和增殖，這表明肌腱細胞對來自其他密切相關細胞的分泌因子有反應。骨骼肌細胞的分泌組包含許多與遷移和增殖相關的生長因子和細胞因子。
 

在重塑階段的后期，有一個由肌腱細胞產生的膠原蛋白I (Col I) 和少量的膠原蛋白III (Col III) 主導的更致密的結締組織。因此，使用 Col I/III 的比值來分析肌腱愈合不同階段的膠原蛋白成分。
 

肌腱細胞的分化有很多特征標志物。Tenascin-C (Tnc) 和波形蛋白 (Vim) 以及 Scx 是通常用于識別肌腱細胞的標志物。S100 鈣結合蛋白 A4 (S100a4) 和 Alpha-Actin smooth muscle 蛋白（Acta2，也稱為 α-SMA）是兩個與肌腱愈合相關的標志物。有研究表明，表達 S100a4 的成纖維細胞與纖維化肌腱愈合呈正相關。CD146 (Mcam) 是肌腱干/祖細胞的標志物。因此，分析 Col I/III 比值和表型標記 Scx、Tnc、Vim、Acta2 和 S100a4 有助于理解肌腱愈合。
 

基于此，瑞典于默奧大學醫學院綜合醫學生物學系、社區醫學與康復學系的專家學者進行了深入研究，他們假設 (1) 來自成肌細胞的分泌組影響肌腱細胞和與肌腱愈合相關的參數，以及 (2) 不同的成肌細胞機械負荷方案在肌腱細胞中誘導不同的反應。
 

實驗研究了與肌腱愈合相關的參數，包括 (i) 遷移、(ii) 增殖 (iii) 細胞表型和 (iv) 膠原蛋白生成。為了克服體內系統的復雜性，使用體外間接共培養系統，在成肌細胞存在的情況下培養肌腱細胞來測試假設，使用拉力系統機械加載成肌細胞。

根據初步數據，細胞在頻率為 1Hz 的情況下接受 5% 的等雙軸動態拉伸應變或著恒定的靜應變。將細胞拉伸 1h，然后間隔 2h。重復此加載 3 次，然后間隔 4h。一個周期共耗時 13h。該方案重復試驗 24h 或 48h。
 

靜態負荷的成肌細胞的分泌組促進肌腱細胞遷移
 

實驗首先檢查了成肌細胞分泌組與機械卸載的成肌細胞共培養時對肌腱細胞遷移的影響。與單獨培養的腱細胞相比，與肌腱細胞共培養的成肌細胞在 24h 后顯著降低了肌腱細胞的遷移（圖1A 左）；然而，這種效果在 48h 后未見（圖1B  左）。
 

接下來測試了成肌細胞的靜態和動態負荷是否會影響肌腱細胞遷移。與卸載的成肌細胞相比，動態加載的成肌細胞在 24h 或 48h 不影響肌腱細胞遷移。然而，與未加載的成肌細胞相比，靜態加載的成肌細胞在 24h 和 48h 都顯著增強了肌腱細胞的遷移（圖1A、B  右）。
 

數據表明，相對于成肌細胞上的負荷類型，肌腱細胞遷移能力有不同的反應。此外，來自靜態加載的成肌細胞的分泌組確實會誘導肌腱細胞的遷移。
 

圖1 與/不與機械加載的成肌細胞共培養的肌腱細胞的細胞遷移。

機械加載的成肌細胞對肌腱細胞增殖和凋亡沒有影響
 

實驗使用 EdU 染色來量化肌腱細胞的增殖率。在 24h 和 4h 各組間未檢測到增殖的顯著差異。此外，在 48h 的蛋白質印跡中未發現增殖標記物增殖細胞核抗原 (PCNA) 的顯著差異。
 

接下來使用乳酸脫氫酶 (LDH) 檢測來量化肌腱細胞中的細胞死亡。24h 和 48h 各組間 LDH 水平無顯著差異，表明沒有誘導肌腱細胞的凋亡和/或壞死。蛋白質印跡進一步證實了這一結果，它顯示 cleaved-Poly（ADP-ribose）polymerase（c-PARP）無顯著差異，這是晚期凋亡活性的標志物。
 

機械加載成肌細胞的分泌組改變肌腱細胞的膠原蛋白表達
 

為了檢測卸載或機械加載的成肌細胞是否影響肌腱細胞膠原蛋白的表達，實驗測量了 mRNA 水平的 Col 1a1 和 Col 3a1 以及細胞內 Col I 和 Col III 的濃度，以及分泌到培養基中的濃度。結果表明，來自卸載的成肌細胞的分泌組在 mRNA 和蛋白質分泌水平上可以調節肌腱細胞中的 Col I/III 比值。
 

接下來，研究人員確定了不同的機械加載方案是否會影響共培養系統中的膠原蛋白生成。靜態或動態加載成肌細胞24h后均未改變腱細胞中 Col 1a1 mRNA 的表達。相比之下，與動態和靜態加載的成肌細胞共培養后，肌腱細胞中的 Col 3a1 mRNA 表達顯著降低。機械加載的成肌細胞的分泌組沒有改變細胞內的 Col I 含量。
 

與未加載的成肌細胞組相比，動態加載的成肌細胞組在 24h 時的培養基中 Col I 和 Col III 的濃度顯著降低，靜態加載的成肌細胞組在 48h 時的培養基中 Col I 和 Col III 的濃度顯著降低。
 

總的來說，這些結果表明成肌細胞分泌組改變了培養基中 Col I 和 Col III 的濃度，成肌細胞的機械負荷改變了肌腱細胞中膠原蛋白的產生。

靜態加載的成肌細胞改變肌腱細胞標志物的表達
 

肌腱分化是肌腱組成的一個重要方面。實驗觀察到與肌腱細胞組相比，與無負荷成肌細胞組共培養的肌腱細胞中的 Tnc mRNA 水平增加；與 24h 單獨培養的肌腱細胞相比，S100a4、Scx 和 Vim 的 mRNA 水平在與未加載的成肌細胞共培養時顯示適度增加。Acta2 和 Mcam 無顯著變化。
 

與未加載的成肌細胞相比，在與靜態加載的成肌細胞共培養的肌腱細胞中，所有三種肌腱細胞分化標志物（Scx、Vim 和 Tnc）的表達均顯著降低。與未加載的成肌細胞相比，靜態加載的成肌細胞的分泌組在 24h 和 48h 增加了肌腱細胞中 S100a4 和 Acta2 的表達。
 

在與動態加載的成肌細胞共培養 48h 后，肌腱細胞中 Scx 水平增加，Vim 表達降低，但 S100a4 和 Acta2 表達保持在對照水平。與動態加載的成肌細胞共培養 24h 和 48h 后，Mcam 在肌腱細胞的表達無顯著變化。
 

這些結果表明動態加載的成肌細胞的分泌組不會像靜態加載的成肌細胞那樣改變肌腱細胞的分化。
 

總之，這項實驗研究了機械負載成肌細胞的分泌組對體外肌腱細胞的影響。生物學終點包括遷移、增殖/凋亡、Col I/III 表達和細胞表型。靜態加載的成肌細胞的分泌組增強了細胞遷移，增加了 Col I/III 比率，并誘導了細胞特征的變化。這是首次研究成肌細胞分泌組對肌腱細胞的影響，以及可能的參與機制是否取決于體外成肌細胞的機械負荷類型。
 

參考文獻：Zhou X, Li J, Giannopoulos A, Kingham PJ, Backman LJ. Secretome from In Vitro Mechanically Loaded Myoblasts Induces Tenocyte Migration, Transition to a Fibroblastic Phenotype and Suppression of Collagen Production. Int J Mol Sci. 2021 Dec 3;22(23):13089. doi: 10.3390/ijms222313089. PMID: 34884895; PMCID: PMC8657858.
 

原文鏈接：https://pubmed-ncbi-nlm-nih-gov.proxy.library.carleton.ca/34884895/
 

圖片來源于參考文獻

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