突破丨超快低光毒60nm超高分辨活細胞成像

李浩宇/陳良怡團隊 合作發明計算超分辨圖像重建算法，穩定提升熒光顯微鏡2倍分辨率

本文作者：北京大學 杜珂 博士

2021年11月16日，哈爾濱工業大學 李浩宇教授（超視計首席專家）團隊與 北京大學 陳良怡教授（超視計首席科學家）團隊合作，以封面論文的形式在 Nature Biotechnology 上發表Sparse deconvolution improves the resolution of live-cell super-resolution fluorescence microscopy【1】。

這篇文章提出了 稀疏解卷積（Sparse deconvolution）方法，可突破現有熒光顯微系統的光學硬件限制，首次實現通用計算熒光超分辨率成像，可提供目前活細胞光學成像中超高空間分辨率（60nm）下，速度更快（564Hz）、成像時間更長（1小時以上）的超分辨成像。

稀疏解卷積（Sparse deconvolution）是基于“熒光圖像的分辨率提高等價于圖像的相對稀疏性增加”這個通用先驗知識，結合陳良怡教授團隊在2018年Nature Biotechnology文章中提出的信號空時連續性先驗知識【2】而發明的兩步迭代解卷積算法。

稀疏解卷積（Sparse deconvolution）的出現，打破了基于光學硬件或者熒光探針的改進無法進一步提升活細胞時空分辨率的僵局。

  【活細胞超分辨成像小知識】  

2014年諾貝爾化學獎授予了熒光超分辨顯微技術，利用熒光分子的化學開關特性（PALM/FPALM/STORM）或者物理的直接受激輻射現象（STED），實現超越衍射極限的超分辨成像。盡管如此，活細胞中的超分辨率成像仍然存在兩個主要瓶頸：

（1）超分辨率的光毒性限制了觀察活細胞中精細生理過程；

（2）受限于熒光分子單位時間內發出的光子數，時間和空間分辨率不可兼得。

受限于這個瓶頸，為了在活細胞上達到60 nm空間分辨率極限，現有超分辨率成像手段需要強照明功率（kW~MW/mm2）、特殊熒光探針和長曝光時間（> 2 s）。強照明功率引起的強漂白會破壞真實熒光結構的完整性，長曝光時間在圖像重構時導致運動偽影，降低有效分辨率。

迄今為止，基于光學硬件或者熒光探針的改進無法進一步提升活細胞超分辨率的時空分辨率，實現毫秒尺度60 nm的時空分辨率成像。

稀疏結構光顯微鏡（Sparse-SIM）的搭建，正是使用了Olympus雙層倒置熒光顯微鏡IX83配合高數值孔徑（NA）油浸物鏡實現。

值得一提的是，本次研究【1】與2018年Nature Biotechnology發表的Hessian SIM文章【2】中，兩篇超高分辨率研究文章均使用了Olympus獨有的NA值高達1.7的超高分辨率物鏡APON100XHOTIRF。

超分辨成像征程的每一步，我們一直風雨兼程，與君同行，讓文獻里遙不可及的理論算法，化為您手上披荊斬棘的研究利器。

早在今年7月在全國生物物理大會上，奧林巴斯攜手超視計科技，聯合發布了SIM-ultimate轉盤-結構光多模態超分辨系統（Spinning Disk Confocal and Structured Illumination jointed Super-Resolution Microscope） （點擊此處了解詳情）。SIM-ultimate以奧林巴斯穩健、開放的轉盤共聚焦系統為平臺，搭載超視計超分辨率結構光(SIM)系統，及本次Nature Biotechnology發表的最新稀疏解卷積（Sparse deconvolution）算法，實現了空間分辨率可達60nm的三維、四色、長時間的活細胞超分辨成像，為各種尺度、各種應用場景的成像需求提供靈活系統的解決方案。

接下來，我們結合文章數據一起看看搭載了稀疏解卷積（Sparse deconvolution）算法的 SIM-ultimate 可以實現哪些應用呢？

     1. 應用舉例：DNA折紙標準樣本驗證     

為了在已知結構樣本中驗證分辨率的提升，研究者設計并合成了兩個熒光標記位點的DNA折紙樣本，每個位點用4~5個Cy5標記。

當這些分子間距為60 nm、80 nm和100 nm時，它們在TIRF-SIM下幾乎無法區分，但在經過稀疏解卷積重建后（Sparse-SIM，圖1）可以很好地區分它們中間的距離。

整體結果可以用單分子定位顯微鏡ROSE【3】交叉驗證，與Sparse-SIM得到的DNA折紙的熒光對間距以及不同間距熒光對在玻片上的分布一致。

圖1：Sparse-SIM解析不同距離DNA折紙樣本。（a）在相同視場下，用配對Cy5標記不同距離（60 nm, 80 nm, 100 nm, 120 nm）的DNA折紙樣品，用TIRF（左）、TIRF-SIM（中）和Sparse-SIM（右）成像。（b）在TIRF、TIRF-SIM和Sparse-SIM下，黃色（60 nm）、藍色（80 nm）(80 nm)、綠色（100 nm）和紅色（120 nm）框包圍的放大區域。比例尺：（a）2 μm；（b）100 nm。

     2. 應用舉例：Sparse-SIM超快活細胞

成像揭示核孔結構和胰島素囊泡早期融合孔道     

在活細胞成像中，稀疏結構光顯微鏡（Sparse-SIM）可以解析標記不同核孔蛋白（Nup35, Nup93, Nup98，或Nup107）的環狀核孔結構，而它們在傳統結構光顯微鏡（2D-SIM）下形狀大小與100 nm熒光珠類似（圖2c, 2d）。由于相機像素尺寸與孔徑直徑類似，測量的核孔擬合直徑與Sparse-SIM的分辨率相當。校正后Nup35和Nup107孔的直徑分別為~66 ± 3 nm和~97 ± 5 nm，而Nup98和Nup93直徑大小處于這個范圍中（圖2e, 2f），結果與以前用其他超分辨成像方法在固定細胞中獲得的直徑相符【4】。有趣的是，12分鐘超分辨成像可以顯示活細胞中核孔形狀變化，這可能反映了核膜上的單個核孔復合物動態重新定向到焦平面或遠離焦平面（圖2g），這是其他超分辨方法難以觀察到的。

圖2：Sparse-SIM解析核孔蛋白動態過程。(c)用Sparse-SIM觀察活COS-7細胞中以Nup98-GFP標記的動態環狀核孔的典型例子，持續時間超過10分鐘。上下區域分別顯示2D-SIM和Sparse-SIM下的圖像。(d)比較 (c)中青色框中的核孔結構快照與100 nm熒光珠在不同重建方法(2D-SIM、20次RL解卷積后、50次RL解卷積后、Sparse-SIM）下的結果。（e）由于核孔的大小與Sparse-SIM的分辨率和像素大小相當，按照Supplementary Note 9.1的協議（詳情請見文章），分別推導出Nup35-GFP（紅色）、Nup98-GFP（黃色）、Nup93-GFP（綠色）和Nup107-GFP（青色）標記的核孔結構的實際直徑。（f）Nup35（66 ± 3 nm, n=30）、Nup98（75 ± 6 nm, n=40）、Nup93（79 ± 4 nm, n = 40）、Nup107（97 ± 5nm ,n = 40）的平均直徑環。左右兩幅蒙太奇分別為傳統Wiener重構或稀疏解卷積后的結果。（g）在6個時間點對 （c）中的品紅色方框放大并顯示。比例尺：（c）500 nm；（d, g, f）100 nm。

通過滾動重建，Sparse-SIM的時間分辨率可達564Hz，識別出來INS-1細胞中VAMP2-pHluorin標記的、更小的胰島素囊泡融合孔道（如~61 nm孔徑）。它們在囊泡融合的早期出現，孔徑小（平均直徑~87 nm），持續時間短（9.5 ms），不能被之前傳統的TIRF-SIM所識別【2】。另一方面，鑒別出來的穩定融合孔在囊泡融合的后期出現，孔徑大（平均直徑~116 nm），持續時間長（47 ms），是之前看到的結構【2】。值得一提的是，雖然這里發現的囊泡早期融合孔狀態很難被其他的超分辨率成像手段所直接驗證，但是它們的發生頻率與30多年前用快速冷凍蝕刻電子顯微鏡所觀察到的“小的融合孔發生概率遠低于大的融合孔”現象相吻合【6】。
     3. 應用舉例：稀疏解卷積是提升熒光顯微鏡分辨率的通用方法     與當下熱門的深度學習超分辨率顯微重建不同，信號的空時連續性、高空間分辨率導致的熒光圖像相對稀疏性這兩個先驗知識，是熒光顯微成像的通用先驗知識，不依賴于樣本的形態以及特定的熒光顯微鏡種類。因此，稀疏解卷積是通用熒光顯微計算超分辨率成像算法，可被廣泛應用于提升其他熒光顯微模態分辨率，觀察不同種類細胞器的精細結構及動態（圖3）。

圖3: 稀疏解卷積廣泛應用于提升不同顯微成像模態空間分辨率，揭示各類細胞器精細結構動態。

比如稀疏解卷積增強的商業超分辨轉盤共焦結構光顯微鏡（SD-SIM）【7】，可以實現XY方向90納米nm，Z方向250nm 納米的空間分辨率，清晰記錄分裂期7 μm深度內的全細胞內所有線粒體外膜網絡（圖4）。同樣，若稀疏解卷積增強與商業SD-SIM結合，因此，在SIM-ultimate系統上可以很容易實現活細胞上的三維、四色超分辨率成像。

此外，稀疏解卷積還可以與膨脹顯微鏡（ExM）【8】結合，解析細胞膨脹后的復雜結構；也可以與寬場、點掃描的共聚焦、膨脹顯微鏡（ExM）【8】、受激輻射損耗顯微鏡（STED）【9】以及微型化雙光子顯微鏡（FHIRM-TPM 2.0）【10】結合，實現近兩倍的空間分辨率提升。因此，稀疏解卷積的提出，將幫助使用各種各樣熒光顯微鏡的生物醫學研究者更好地分辨細胞中的精細動態結構。

圖4: Sparse SD-SIM解析活細胞三維線粒體外膜網絡。（k）活體COS-7細胞的線粒體外膜（Tom20-mCherry標記）的三維分布，顏色表征深度。（l）SD-SIM原始數據與Sparse SD-SIM的水平（左）和垂直（右）的白色框區域放大展示。比例尺：（k）5 μm；（l）1 μm。

總之，通過稀疏解卷積算法（Sparse deconvolution）來實現計算熒光超分辨率成像，與目前基于特定物理原理或者特殊熒光探針的超分辨率方法都不相同。與超快結構光超分辨顯微鏡結合形成的Sparse-SIM是目前活細胞光學成像中，分辨率更高（60納米）、速度更快（564幀/秒）、成像時間更長（1小時以上）的超分辨光學顯微成像手段。

     4. SIM-ultimate: 摘星攬月 觸手可得     

在生命科學探索的雄關漫道中，奧林巴斯一直致力于以百年的深厚積淀，為您的成像研究征程添油助力。SIM-ultimate轉盤-結構光多模態超分辨系統，以奧林巴斯穩健、開放的轉盤共聚焦系統為平臺，搭載超視計超分辨率結構光（SIM）系統及最新稀疏解卷積（Sparse deconvolution）算法，實現了共聚焦與結構光照明技術兩大超分辨成像技術的雙劍合璧，實現了空間分辨率可達60nm的三維、四色、長時間的活細胞超分辨成像，完美平衡了時空分辨率、光毒性、成像視野及成像深度各方面的成像需求。SIM-ultimate開啟了一種全新的聯合成像工作模式——joint working模式，基于完全共用的熒光標記方式，打通Spinning Disk Confocal、Spinning SR、2D-SIM、TIRF-SIM等成像模式。專注于活細胞超分辨成像研究，提供多種尺度、多種模態的成像模式以及稀疏解卷積算法在內的多種獨家超分辨算法，靈活切換，組合出擊，從宏觀到微觀，從結構到動態，分毫必現，無所不及。

哈爾濱工業大學博士生趙唯淞、北京大學博士后趙士群、李柳菊為共同第一作者，哈爾濱工業大學儀器科學與工程學院李浩宇教授和北京大學未來技術學院陳良怡教授為論文共同通訊作者，共同作者還包括哈爾濱工業大學譚久彬院士、劉儉教授，北京大學毛珩博士，生科院成像平臺單春燕博士和華南師范大學劉彥梅教授。參與合作的實驗室包括武漢大學宋保亮教授、北京大學陳興教授、中科院國家納米科學中心丁寶全教授和生物物理所紀偉教授等。該項工作得到北京大學膜生物學重點實驗室、麥戈文腦研究所、北大-清華生命科學聯合中心、北京智源人工智能研究院的支持，也是多模態跨尺度國家生物醫學成像設施建設過程中的重要成果。
原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41587-021-01092-2

參考文獻：

[1] Weisong Z, Shiqun Z, Liuju L, et al. Sparse deconvolution improves the resolution of live-cell super-resolution fluorescence microscopy [J]. Nature biotechnology, 2021: DOI: https://doi.org/10.1038/s41587-021-01092-2.

[2] Huang X, Fan J, Li L, et al. Fast, long-term, super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy [J]. Nature biotechnology, 2018, 36(5): 451-459.

[3] Gu L, Li Y, Zhang S, et al. Molecular resolution imaging by repetitive optical selective exposure [J]. Nature Methods, 2019, 16(11): 1114-1118.

[4] Szymborska A, Marco A d, Daigle N, et al. Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging [J]. Science, 2013, 341(6146): 655-658.

[6] Ornberg R L, Reese T S. Beginning of exocytosis captured by rapid-freezing of Limulus amebocytes [J]. The Journal of Cell Biology, 1981, 90: 40 - 54.

[7] Schulz O, Pieper C, Clever M, et al. Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy [J]. PNAS, 2013, 110(52): 21000-21005.

[8] Sun D-E, Fan X, Shi Y, et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules [J]. Nature Methods, 2021, 18: 107–113.

[9] Hell S W, Wichmann J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy [J]. Optics Letters, 1994, 19(11): 780-782.

[10] Zong W, Wu R, Chen S, et al. Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging [J]. Nature Methods, 2021, 18(1): 46-49.

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