Identification of Novel Rotihibin Analogues in Streptomyces scabies, Including Discovery of Its Biosynthetic Gene Cluster

疥瘡鏈霉菌中新型Rotihibin類似物的鑒定，包括其生物合成基因簇的發現

疥瘡鏈霉菌是一種與常見疥瘡相關的植物病原菌。這主要歸因于它能夠產生植物毒素thaxtominA，其生物合成由纖維二糖觸發。在對纖維二糖存在時釋放的其他代謝物的調查中，我們在含有疥瘡鏈霉菌的thaxtomin提取物中發現了其他化合物。質譜（MS）和核磁共振（NMR）結構分析表明，這些化合物是TOR（雷帕霉素靶點）激酶（TORK）途徑抑制性脂肽rotihibin A的氨基酸序列變體，主要化合物命名為rotihibin C和D。與thaxtomin相反，在葡萄糖存在的情況下也能誘導產生Rotihibin C和D，這表明它們的生物合成受到不同的調節。通過鳥槍和靶向蛋白質組學的結合，在S。疥瘡87-22。該簇跨越33kbp，編碼2種不同的非核糖體肽合成酶（NRPSs）和12種附加酶。在其他公開獲得的完整放線菌基因組中發現了同源rth生物合成基因簇。Rotihibin C和D在低濃度下對小檸檬和擬南芥表現出除草活性，通過監測對生長的影響和光系統II的最大光化學效率可以看出。

關鍵詞：鏈霉菌；TORK；常見痂；脂肽；非核糖體肽；蛋白質組學

圖1.纖維二糖對疥瘡鏈霉菌RL-34分泌代謝組的影響

已知纖維二糖可誘導Streptomyces scabies 中 thaxtomin A 的產生。假設纖維二糖還引發其他對根和塊莖作物感染很重要的毒力因子的產生。當比較來自在國際鏈霉菌計劃培養基 4 (ISP-4) 中生長的 S.scabies RL-34 培養物的培養基正丁醇提取物的高效液相色譜 (HPLC) 譜時，無論是否添加0.7%纖維二糖，在纖維二糖存在下生長后獲得的提取物的HPLC曲線中出現了新峰（圖 1）。

圖2.蛋白質的相對豐度作為非核糖體肽機制的一部分，以響應纖維二糖(CB)(Glc2) 或葡萄糖(Glc)供應，由靶向蛋白質組學(LC-MRM) 確定

除了thaxtomin 生物合成基因簇 (BGC)，S.scabies 還擁有其他四種NRP合酶(NRPS)型BGC；其中兩個是神秘的，即BGC尚未與遺傳物質相關聯的生物分子。在之前的蛋白質組學實驗中發現了與神秘的NRPS型BGC（從 scab_3221到scab_3351）相關的蛋白質。我們通過使用多反應監測 (MRM) 的靶向蛋白質組學研究了這種BGC與rotihibin產生之間的可能關系。SCAB_3241、SCAB_3251、SCAB_3281、SCAB_3291、SCAB_3301和SCAB_3321的蛋白型肽用于評估蛋白質水平。圖2顯示了葡萄糖或纖維二糖的存在與所選蛋白質的產生之間的正相關，從而提供了第一個證據，證明輪替抑制素的產生與這種神秘的BGC可能存在聯系。有趣的是，纖維素利用調節因子cebR的失活對該簇的酶的產生沒有影響，甚至對scab_3221 基因產物產生相反的影響(15)。這表明纖維二糖對NRPS基因簇表達的影響不依賴于cebR并且與thaxtomin的產生沒有協同調節。

圖3.RotihibinC對Lemna minor光系統II最大光化學效率的影響

圖4.RotihibinD對Lemna minor光系統II最大光化學效率的影響

此外，本文使用FV/FM比率作為代理評估了rotihibinsC和D對光系統II光化學的影響。在暗適應FV/FM測量中，測量的是最小熒光(F0)。接下來，使用強光閃光關閉（減少）所有反應中心并測量最大熒光，稱為FM。FM2F0的差值是FV值。FV/FM比率代表光系統II的最大潛在量子效率。 一般來說，植物壓力越大，可用的開放反應中心就越少，這導致FV/FM比率降低。RGB和葉綠素熒光圖像在補充材料中的圖S2至S5中描述。以FV/FM比率為代表，光系統II的最大光化學效率隨著營養培養基中 rotihibin濃度的增加呈下降趨勢，表明rotihibins影響L.minor的光合作用（圖3和圖4）。

圖5.rotihibins C和D對擬南芥的影響

施用后96小時的序數分析也表明，用0.1mM Rotihibin C和D處理的擬南芥植株的生長和光系統II（FV/FM）（52）的最大光化學效率受到影響（圖5）。在這里，沒有向營養培養基中添加Rotihibin，而是將其噴灑到植物上；這就解釋了與L微量生物測定。大多數除草劑作為水基噴霧劑使用，這是農民保護植物產品的最簡單方法。陽性對照品為商用草甘膦制劑（RoundUp Turbo），摩爾濃度約為3m。在較低濃度的rotihibin D（0.05mM和0.005mM）下，觀察到對擬南芥幼苗的生長促進作用，這再次反映了一種激素效應（圖6）。