熒光定量PCR 是PCR實驗中常見的PCR類型，下面歸納一下，客戶進行PCR實驗時常遇見的一些問題。希望對具有PCR恐懼癥的伙伴們能有所幫助。

常見問題一： 熒光定量PCR的類型有幾種？有何區別？
答：目前熒光定量PCR實驗常用的方法主要有兩種，即：SYBR Green I染料法和Taqman探針法，兩者的主要區別在于：SYBR Green 染料的特點是只與DNA雙鏈相結合發出熒光，而當熒光染料處在游離狀態時，不會發出熒光。所以在PCR循環體系中熒光信號強度與PCR產物的數量成正比例關系。染料法熒光定量的優點是通用性比較強，幾乎適用于所有的熒光定量PCR反應但也具有明顯非特異性。如果PCR反應過程中出現引物二聚體或者進行非特異性擴增時，該染料也會這些非特異性擴增產物結合從而激發熒光，形成假陽性信號，對PCR定量結果一定的干擾，從而影響到PCR定量結果的準確性。

常見問題二：熒光定量實驗中無擴增曲線是什么原因導致？
答：一般來說，在熒光定量PCR實驗中，無擴增曲線主要會有以下三種情況：
凝膠電泳時無條帶出現，無擴增曲線。
這種情況需要考慮引物的設計是否合理？引物質量是否正常？退火溫度設置是否合理？擴增體系是否正常等等。
2.第二種情況比較容易出現的是在做電泳時會正常顯示條帶，但沒有明顯的擴增曲線。這種情況有可能是探針合成過程出現問題；如果探針過程正常，則需要檢查探針淬火溫度、程序參數設定問題確排除后則可能是儀器故障導致。
3.另外，模板被降解或模板不足時也會出現無曲線擴增現象。

常見問題三：熒光定量PCR時，有哪些需要注意的？
答：在進行熒光定量PCR實驗室時，需要注意以下幾點：
1.PCR實驗室要有獨立的分區：一般PCR實驗室的樣品處理區、PCR反應制備區、PCR擴增區，數據報告區等相互獨立使用放置DNA污染；
2.配置標準品的工具，包括移液器、吸頭等單獨使用一套工具，并且移液器的吸頭是帶濾芯的標準吸頭。
3.盡量不要用記號筆或標簽在PCR管上做標記，以免影響儀器的熒光檢測
4.PCR管或8排管使用完后，及時歸入在指定的廢棄放置區，不要與試驗區域內的樣本混用。
5.每個步驟都需要做好防止DNA貨RNA污染措施。