復旦大學附屬華山醫院運動醫學科陳世益教授領導的研究團隊近日在生物材料領域頂尖期刊《Biomaterials》（IF = 10.317）上發表文章，證明了一種間充質干細胞的條件培養基在促進腱-骨愈合上具有積極作用。



肩袖撕裂是一種常見的運動損傷，威脅著專業運動員及廣大運動愛好者的健康。醫生大多采用肩袖修復術將撕裂的肌腱重新固定在骨表面。大多數患者能夠獲得良好的效果，但有些患者會發生再次撕裂。出現這種現象的原因是止點（enthesis）無法快速再生腱-骨界面的結構。止點是肌腱或韌帶附著于骨頭的部位。

基于再生醫學的干細胞治療有望為肩袖損傷提供新的治療手段。人們已采用不同來源的間充質干細胞（MSC）來促進腱-骨愈合，并在實驗中獲得了成功。然而，引入外源性材料也存在風險。植入的干細胞可能具有致瘤性，這限制了臨床應用。近期的研究發現，真正有效的是干細胞的分泌組（secretome），而間充質干細胞的條件培養基包含了干細胞分泌的所有營養因子。

基于此，研究人員收集了人類骨髓來源干細胞的條件培養基（hBMSC-CM），并檢測了這種無細胞方法是否能夠在大鼠肩袖修復模型中促進腱-骨愈合。為了確保培養基在腱-骨界面處局部釋放，他們將小塊的海綿浸泡在培養基中，然后植入肩袖修復處。之后，他們利用相關細胞系在體外驗證了觀察到的結果，并在體內進一步研究了hBMSC-CM介導的腱-骨愈合作用（圖1）。
 

圖1. 研究技術路線圖

hBMSC-CM促進了大鼠肩袖處的腱-骨愈合

研究人員首先利用賽業的間充質干細胞分化培養基，對間充質細胞進行了鑒定。他們接著收集了間充質干細胞的條件培養基，測定了幾種生長因子的濃度。他們發現，培養基中含有TGF-β、VEGF和IGF-1等能夠促進腱-骨愈合的生長因子。

之后，他們將海綿切成1mg的小塊，在滅菌后放入hBMSC-CM中浸泡30分鐘，并植入大鼠的肩袖修復處。術后4周和8周，他們通過組織學和放射學方法觀察到了再生的止點（圖2）。Micro-CT顯示，CM組修復區域的骨密度顯著高于DMEM對照組。

由于成纖維細胞是腱-骨止點重建的主要參與者，他們還檢測了腱-骨界面處的α-SMA連續表達。根據免疫組化染色分析，兩組患者主要在術后2周表達α-SMA。定量分析結果表明，CM組的陽性面積顯著高于DMEM組，表明CM組的重建過程更為活躍。這些結果顯示，hBMSC-CM可提高再生止點的質量，促進腱-骨愈合。
 

圖2. 肩袖修復后再生止點的組織學和放射學分析

hBMSC-CM的積極作用與巨噬細胞有關

體內實驗表明，海綿的完全降解期約為2周，與炎癥期重疊。在炎癥發生期間，巨噬細胞浸潤在腱-骨界面。于是，研究人員分析了hBMSC-CM是否在體內和體外影響巨噬細胞的表型。免疫組化結果顯示，術后2周，CM組的CD86（M1表型標志物）水平顯著低于DMEM組，而CD163（M2表型標志物）水平顯著高于DMEM組，表明hBMSC-CM能夠抑制M1表型并促進M2表型（圖3）。

與表型變化一致，促炎細胞因子（TNF-α、IL-1α和 IL-1β）和抗炎細胞因子（TGF-β、IL-10和IL-13）的濃度也發生了變化。在LPS刺激后，促炎細胞因子的mRNA和蛋白質水平顯著升高，而抗炎細胞因子的mRNA水平沒有顯著變化。不過，hBMSC-CM的干預下調了促炎細胞因子的水平，而增強了抗炎細胞因子的表達。
 

圖3. hBMSC-CM對巨噬細胞表型的影響

那么，hBMSC-CM對體內腱-骨愈合的積極作用是否取決于巨噬細胞的存在？為了解答這個問題，研究人員使用了巨噬細胞清除（MC）大鼠，并觀察了hBMSC-CM對MC大鼠肩袖腱-骨愈合的影響。通過組織學和生物力學分析，他們發現巨噬細胞清除可促進大鼠肩袖的腱-骨愈合，但在沒有巨噬細胞的情況下，hBMSC-CM失去了其優勢，表明hBMSC-CM對腱-骨愈合的積極作用依賴于巨噬細胞。

hBMSC-CM通過Smad2/3通路
調控巨噬細胞的極化

最后，研究人員探索了hBMSC-CM調控巨噬細胞極化的機制。在LPS刺激后，hBMSC-CM能夠顯著升高Smad2/3的磷酸化水平，而抑制劑SB431542有效抑制了Smad2/3磷酸化。同時，SB431542顯著逆轉了hBMSC-CM對巨噬細胞極化的影響。當Smad2/3激活被SB431542阻斷后，hBMSC-CM對促炎細胞因子的抑制作用和對抗炎細胞因子的促進作用也被消除。這一現象表明，在炎性環境下，Smad2/3信號通路參與了hBMSC-CM對巨噬細胞極化的調控。

基于這些結果，研究人員認為hBMSC-CM通過促進巨噬細胞向M2表型極化并抑制M1表型，促進了大鼠模型肩袖處的腱-骨愈合。在hBMSC-CM的刺激下，成纖維細胞在腱-骨界面處積累，伴隨著纖維軟骨（fibrocartilage）的更早形成以及數量更多。再生的止點不僅更加有序，而且具有更好的生物力學性能（圖4）。考慮到無細胞hBMSC-CM的安全性，研究人員認為它有望應用于臨床來促進腱-骨愈合。
 

圖4. 大鼠肩袖修復后的腱-骨愈合示意圖

原文檢索：
Chen W, Sun Y, Gu X, Cai J, Liu X, Zhang X, Chen J, Hao Y, Chen S. Conditioned medium of human bone marrow-derived stem cells promotes tendon-bone healing of the rotator cuff in a rat model. Biomaterials. 2021 Feb 11;271:120714. doi: 10.1016/j.biomaterials.2021.120714. Epub ahead of print. PMID: 33610048.