腫瘤免疫治療是當(dāng)前癌癥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，而對(duì)腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的全面分析一直是該領(lǐng)域中一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。本研究中，作者通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組+TCR測(cè)序技術(shù)對(duì)腫瘤小鼠和黑色素瘤患者的血液和腫瘤組織進(jìn)行分析，利用TCR序列作為“分子條形碼”的方法為鑒定循環(huán)抗腫瘤 CD8⁺ T 細(xì)胞提供新的思路。

Single-cell analyses identify circulating anti-tumor CD8 T cells and markers for their enrichment

發(fā)表時(shí)間：2021.3.2（published online）

發(fā)表期刊：Journal of Experimental Medicine ; IF=11.743

實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：10x Genomics Chromium（5’表達(dá)文庫(kù)+VDJ富集文庫(kù)）、CITE-seq

樣本類型和數(shù)量：５只皮下結(jié)腸腺癌模型小鼠和4位黑色素瘤患者，血液和腫瘤 

DOI: 10.1084/jem.20200920

研究背景 

腫瘤免疫治療徹底改變了固體和液體腫瘤的治療方式。新 CD8⁺ T 細(xì)胞從循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到腫瘤組織，即“克隆替代”，與免疫療法更好的反應(yīng)相關(guān)。但是，目前需要改進(jìn)方法來(lái)鑒定針對(duì)腫瘤的T細(xì)胞，以將分析集中于少數(shù)具有預(yù)后和功能相關(guān)性的循環(huán)T細(xì)胞。

本研究中，作者使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)來(lái)跟蹤血液中與腫瘤相關(guān)的T細(xì)胞反應(yīng)。使用TCR作為“分子條形碼”，使用成對(duì)的腫瘤和血液樣本來(lái)識(shí)別和表征腫瘤匹配(TM)血液CD8⁺ T細(xì)胞，這些細(xì)胞與小鼠MC38腫瘤或患者黑色素瘤中的CD8⁺ T細(xì)胞具有相同的TCR序列。對(duì)檢查點(diǎn)阻斷無(wú)反應(yīng)患者的兩個(gè)縱向樣本中，TM細(xì)胞轉(zhuǎn)變并出現(xiàn)更強(qiáng)的功能障礙信號(hào)。研究者鑒定了富集TM細(xì)胞的候選表面標(biāo)記，并在小鼠中使用CITE-seq驗(yàn)證了三種標(biāo)記。重要的是，與單一標(biāo)記相比，這些標(biāo)記基因的聯(lián)合在鑒定TM細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)了更好的性能。

研究?jī)?nèi)容

1、用MC38腫瘤中匹配的CD8+ T細(xì)胞的TCR表征血液中的CD8⁺ T細(xì)胞

由于TCR編碼抗原特異性，研究者假設(shè)TCR序列可用于評(píng)估血液中哪些克隆與抗腫瘤反應(yīng)相關(guān)。為了測(cè)試這一點(diǎn)，從小鼠配對(duì)的血液和MC38腫瘤中分離出的CD8⁺ T細(xì)胞進(jìn)行了scRNAseq和TCR測(cè)序。通過(guò)對(duì)鑒定到的細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤中CD8⁺ T細(xì)胞多樣性高。

為了評(píng)估腫瘤和血液中的克隆重疊，用TCR序列將二者的CD8⁺ T細(xì)胞進(jìn)行匹配，并進(jìn)行匹配細(xì)胞（TM）與非匹配細(xì)胞（非TM）的差異基因和信號(hào)通路富集分析，結(jié)果顯示，TM細(xì)胞富集效應(yīng)器信號(hào)、免疫效應(yīng)過(guò)程和淋巴細(xì)胞遷移功能，非TM細(xì)胞則富集了原始CD8⁺ 細(xì)胞信號(hào)功能。使用從公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到的特征基因，發(fā)現(xiàn)TM細(xì)胞富集激活和TRM特征，而非TM細(xì)胞富集原始特征。總的來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果與TM細(xì)胞對(duì)腫瘤的積極反應(yīng)一致，而且支持使用TCR來(lái)鑒定TM細(xì)胞而不是依賴單個(gè)標(biāo)記物（如PD-１）。

Fig 1. 基于TCR序列的CD8+ T細(xì)胞scRNAseq鑒定血液中MC38 TM克隆

2、通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)血液中TM CD8⁺ T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征可用于鑒定富集標(biāo)記

為了測(cè)試單基因的表面marker是否可以識(shí)別TM細(xì)胞成分，研究者開(kāi)發(fā)了COMET計(jì)算工具來(lái)從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中預(yù)測(cè)marker基因，并鑒定到了82個(gè)候選陽(yáng)性標(biāo)記。并通過(guò)CITE-seq驗(yàn)證了CD39、CX3CR1、NKG2D三個(gè)蛋白聯(lián)合比單一標(biāo)記更能提高鑒定TM細(xì)胞的敏感性和特異性。因此，除了TCR，細(xì)胞表面標(biāo)記物也可被用于區(qū)分TM細(xì)胞和非TM細(xì)胞。

Fig 2. 細(xì)胞表面marker panels可以從血液中富集TM細(xì)胞

3、血液中的TM CD8⁺ T細(xì)胞比腫瘤中的匹配克隆具有更低程度的功能失調(diào)

研究者接下來(lái)檢測(cè)腫瘤中CD8⁺ T細(xì)胞（其TCR在血液中也能被檢測(cè)到，即“血液匹配”細(xì)胞）的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性。功能分析顯示“血液匹配”細(xì)胞展現(xiàn)出更高水平的終末衰竭信號(hào)和TRM信號(hào)，以及更低水平的原始T細(xì)胞信號(hào)。這些發(fā)現(xiàn)表明，血液中的TM成分對(duì)應(yīng)于腫瘤中的匹配克隆，這些克隆可能對(duì)腫瘤抗原有反應(yīng)并與腫瘤殺傷相關(guān)。

接下來(lái)，研究者將血液中TM細(xì)胞的表達(dá)譜與腫瘤中的匹配克隆進(jìn)行了比較并發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)的血液匹配群體比血液中的克隆群體更具多樣性，說(shuō)明CD8⁺ T細(xì)胞在進(jìn)入腫瘤時(shí)發(fā)生變異并呈現(xiàn)出多種狀態(tài)。在群體水平和逐個(gè)克隆基礎(chǔ)上將TM細(xì)胞與腫瘤中“血液匹配”細(xì)胞相互比較，發(fā)現(xiàn)TM細(xì)胞顯著富集更多的類效應(yīng)器特征而“血液匹配”細(xì)胞更富集末端耗竭特征。這些數(shù)據(jù)表明血液中的TM細(xì)胞的功能障礙比腫瘤中的匹配細(xì)胞弱，并且在遷移到腫瘤中后，這些細(xì)胞獲得了功能障礙狀態(tài)。

Fig 3. 血液中的TM CD8+ T細(xì)胞比腫瘤中相應(yīng)克隆的功能障礙更低

4. 黑色素瘤患者的血液中可以檢測(cè)到活化的TM CD8⁺ T細(xì)胞

研究者對(duì)4名未接受過(guò)檢查點(diǎn)治療的晚期黑色素瘤患者的血液和腫瘤樣品進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組+TCR測(cè)序，使用TCR序列作為分子條形碼來(lái)檢測(cè)血液中的TM細(xì)胞。其中每個(gè)病人的TM細(xì)胞主要存在于非原始細(xì)胞亞群中，且占比極高。另外TM細(xì)胞和非TM的表型特征都與小鼠實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，支持了血液中的TM細(xì)胞功能障礙可能比腫瘤中的匹配細(xì)胞弱的觀點(diǎn)。
 

Fig 4. TM CD8⁺ T細(xì)胞克隆可以在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的血液中檢測(cè)到，并且比腫瘤中的匹配克隆表現(xiàn)出更少的功能障礙跡象

5. 進(jìn)行抗PD-1 治療后，患者血液縱向追蹤TM CD8⁺ T細(xì)胞并顯現(xiàn)出衰竭程度隨時(shí)間增加

對(duì)檢查點(diǎn)阻礙沒(méi)有反應(yīng)的兩個(gè)病人后續(xù)得到的血液樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)病人的血液和腫瘤樣品檢測(cè)到重疊的TCR。且隨著時(shí)間的推移，血液中的TM細(xì)胞可能會(huì)變得更加衰竭，但最終是腫瘤中的衰竭水平更高。

進(jìn)一步的量化分析表明，TM組分相對(duì)于非TM組分的總體轉(zhuǎn)錄圖譜保持高度一致性。對(duì)病人間變異性分析發(fā)現(xiàn)TM或非TM組分特異的個(gè)體基因轉(zhuǎn)錄程度具有顯著相關(guān)性。若只在細(xì)胞表面marker里做這種分析也存在相關(guān)性，說(shuō)明表面表達(dá)marker可被用于鑒定TM群體，它們?cè)诓煌�腫瘤負(fù)荷和治療條件下都有很強(qiáng)的穩(wěn)定性。

Fig 5. 黑色素瘤患者的縱向血液樣本中可以檢測(cè)到匹配的克隆

6. 細(xì)胞表面marker聯(lián)合用于檢測(cè)患者血液中的TM成分

為了找到合適的用于富集TM細(xì)胞的marker，研究者再次使用COMET。經(jīng)過(guò)篩選，研究者發(fā)現(xiàn)了四個(gè)低表達(dá)基因LTB、CCR7、GYPC和FLT3LG，在不同腫瘤負(fù)荷和治療條件下都有穩(wěn)健的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)兩個(gè)陽(yáng)性marker，KLRD1和LGALS1。為了提高這些marker從血液中分離TM細(xì)胞的性能，研究者將它們聯(lián)合嘗試。在所有樣品中，兩個(gè)或多個(gè)基因比單標(biāo)記的敏感性和特異性顯著提高。最后，研究者還使用GLIPH2和iSMART兩個(gè)工具對(duì)TCR重新聚類，并再次驗(yàn)證marker的穩(wěn)定性，得到了與之前相近的結(jié)果。

Fig 6. 鑒定用于跨患者追蹤TM細(xì)胞的標(biāo)記組合

結(jié)論

本研究使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組+TCR測(cè)序方法，利用TCR序列作為分子條形碼來(lái)檢測(cè)和表征MC38腫瘤小鼠和黑色素瘤患者的血液中的TM CD8⁺ 細(xì)胞。
得到以下結(jié)果：
1. 與血液中的非匹配T細(xì)胞相比，TM細(xì)胞具有更強(qiáng)的活化作用，而且與腫瘤中相匹配的細(xì)胞相比有更低的耗竭性。

2. 已經(jīng)被用于識(shí)別循環(huán)抗腫瘤CD8⁺ T細(xì)胞的PD-1，識(shí)別TM細(xì)胞時(shí)敏感性較差。

3. 在小鼠和患者中確定了TM細(xì)胞的候選細(xì)胞表面marker，并在小鼠中證實(shí)了其中的NKG2D、CD39和CX3CR1。

這些數(shù)據(jù)結(jié)果表明，TCR可用于鑒定與腫瘤相關(guān)的細(xì)胞，揭示TM細(xì)胞獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄特性，以及開(kāi)發(fā)用于追蹤和分析這些細(xì)胞的marker panel。

參考文獻(xiàn)
Pauken, Kristen E et al. “Single-cell analyses identify circulating anti-tumor CD8 T cells and markers for their enrichment.” The Journal of experimental medicine vol. 218,4 (2021): e20200920.