背景

膜蛋白是生物膜功能的主要執行者，在生物體內參與許多重要的生理過程。但是，由于很難獲得穩定均勻且維持膜蛋白正確構象的膜模擬環境，膜蛋白研究遠遠滯后于水溶性蛋白。磷脂納米盤（Nanodisc）是由高密度脂蛋白發展而來的用于膜蛋白研究的新類型膜結構。將膜蛋白與Nanodisc組裝起來，是膜蛋白研究的有效方法。制備納米盤的一種常用方法是將苯乙烯-馬來酸(SMA)添加到完整的細胞膜上，從而自發地生成SMA-脂質顆粒（SMALP）的納米盤¹。

微流體擴散分級(MDS)使用微流控分析芯片將蛋白質樣本送入一個通道，在這個通道中，蛋白質樣本與輔助流體一起以穩定的層流狀態流動，沒有混合。蛋白質從一個流層轉移到另一個流層的唯一途徑是擴散，擴散的速率與蛋白質的大小流體動力學半徑R_h成正比。R_h的改變表明分子結合事件的發生。

 

摘要

在本應用中采用MDS技術的Fluidity one-W檢測到了SMALP納米盤的形成，而且揭示了SMA與脂質體的比例是如何影響SMALP納米盤的大小，這是表征嵌入膜蛋白的一個關鍵參數。

低SMA/脂質體比例下，SMALP納米盤開始形成。隨著SMA/脂質體比例的升高，單層囊泡開始降解，大的異質性SMALP逐漸形成。在更高的SMA/脂質體比例下，SMALPs的平均流體動力學半徑（R_h）縮小了4.5倍，這使得其內嵌的脂質大大減少了。

納米盤這種大小變化極大地改變了內嵌膜蛋白周圍的環境，因此在生物物理和生化應用中需要加以考慮。

因此，對于研究或使用SMALPs，以根據實驗需求調整SMALP大小的研究人員來說，Fluidity one-W是一個理想的工具。

方法

1.制備熒光標記的脂囊泡

1-棕櫚酰基-2-油酰-SN-甘油-3-磷酰膽堿(POPC)和1-棕櫚酰-2-(二吡啶甲基硼二氟)十一烷基酰-SN-甘油-3-磷酸膽堿(TopFluor® PC; both Avanti Polar Lipids)混合，得到1 mol% 的TopFluor PC。

氯仿蒸發,脂質膜干燥過夜，加入PBS緩沖(pH值7.4)，得到總脂質濃度10mM。10 mM脂質(POPC / TopFluor PC 1 mol%)穿過孔隙大小100 nm的聚碳酸酯膜30次，得到熒光標記大單層囊泡(LUVs)。

通過動態光散射分析得到的熒光標記LUVs，其z-平均流體動力學直徑為118±7 nm，多分散性指數為0.2±0.08。

2.制備SMALP納米盤

PBS (pH7.4)稀釋苯乙烯-馬來酸(SMA 3:1)共聚物原液。為分析納米盤的形成，將LUVs與SMA以不同比例混合，在21℃溫度下孵育至少2小時。Fluidity One-W檢測樣品。

結果

在微流控芯片上，當樣品通過芯片時，記錄未擴散樣品(F_undiffused)和擴散樣品(F_diffused)的熒光強度。

沒有加入SMA時，完整LUVs的熒光信號比(SR)，SR=F_diffused/F_undiffused，為~0.15，為低擴散水平。

 

相比之下，在SMA存在的情況下，熒光SR值為0.75，表明大的LUV轉化為小得多的微小納米盤，引起了更高水平的擴散。

 

為了分析SMA與脂質的比例如何影響SMALP納米盤的大小，不同濃度(25 µM, 50 µM 和100 µM)的熒光標記LUVs與SMA混合。

當SMA/脂質≥0.08時，SR的增加表明SMA從LUVs中提取脂質，形成小顆粒物，與完整的LUVs共存。

SMA /脂質= 0.15時， LUV完全溶液化²。根據Fluidity one-W檢測結果，SMA /脂質= 0.15時， SMALP納米盤平均R_h是20 nm；隨著SMA比例的提高，最小R_h為4.5 nm 。

根據測量的Rh值，確定了納米盤的半徑(R_disc) ³。假設POPC-雙分子層厚度為4 nm⁴，那么R_h值為20 nm和4.5 nm時，R_disc值分別為26 nm和5 nm。

這種R_disc的變化可直接轉化為嵌入的脂質的數量。

 

 

 

結論

Fluidity one-W利用MDS技術，直接在溶液中檢測分子結合事件，是一種通過微量樣品檢測SMALP納米盤形成的理想工具。SMALP納米盤的平均流體動力學半徑根據SMA/脂質比例不同從20 nm到4.5 nm不等。這種大小的變化將顯著改變任何嵌入蛋白周圍的脂質環境，因此在納米盤研究中至關重要。

采用微流控擴散（MDS）技術的Fluidity one-W是一款非常實用的分子互作儀。研究人員可以在溶液中以及在復雜的生物學背景（例如粗裂解液或血漿中）研究蛋白質相互作用。還可以分析難以研究的蛋白質(例如膜蛋白質，多蛋白質復合物和固有紊亂的蛋白質)的相互作用，其中許多蛋白質都是重要的藥物靶標。此外，由于它報告了結合和未結合物質的絕對大小，因此可以與結合親和力同時評估化學計量和結合性質，從而全面了解結合事件。

 

 

 

//親和力檢測

//蛋白穩定性檢測

//化學計量參數檢測

//直接檢測血清中抗體濃度和親和力

//膜蛋白分子互作最佳檢測方法

//在溶液中直接檢測，更接近天然狀態

//非表面結合原理，無需擔心非特異性結合

//兼容細胞裂解液、培養基、血清等復雜的溶液背景

參考文獻

1、Dörr,      J.M.; Scheidelaar, S.; Koorengevel, M.C.; Dominguez, J.J.; Schäfer, M.;      van Walree, C.A.; Killian, J.A. The Styrene-Maleic Acid Copolymer: A      Versatile Tool in Membrane Research. Eur Biophys J Biophy. 2016, 45, 3-21.      (publication)

2、Vargas,      C.; Cuevas Arenas, R.; Frotscher, E.; Keller, S. anoparticle self-assembly      in mixtures of phospholipids with styrene/maleic acid copolymers or      fluorinated surfactants. Nanoscale.      2015,      7, 20685-20696. (publication)

3、Glover,      K.J.; Whiles, J.A.; Wu, G.; Yu, N.; Deems, R.; Struppe, J.O.; Stark, R.E.;      Komives, E.A.; Vold, R.R. Structural evaluation of phospholipid bicelles      for solution-state studies of membrane-associated biomolecules. Biophys. J. 2001, 81,      2163-2171. (publication)

4、Kučerka,      N.; Nieh, M.P.; Katsaras, J. Fluid phase lipid areas and bilayer      thicknesses of commonly used phosphatidylcholines as a function of      temperature. BBA-Biomembr.      2011,      1808, 2761-2771. (publication)