應用 LAL動態(tài)濁度法測定復方苦參注射液中細菌內(nèi)毒素含量
 

王信１，馮宇２*，范祥元３，楊喆２，高蕾２（１. 國家食品藥品監(jiān)督管理總局高級研修院，北京 100073；２. 科德角國際生物醫(yī)學科技（北京）有限公司，北京 100068；３. 安徽省食品藥品檢驗研究院，合肥 230051）

摘要 目的：建立應用美洲鱟試劑LAL的動態(tài)濁度法定量檢測復方苦參注射液中細菌內(nèi)毒素試驗方法。
方法：采用《中國藥典》2015年版（四部）中的細菌內(nèi)毒素檢查法。結(jié)果：復方苦參注射液用細菌內(nèi)毒素定量法檢測無干擾因素影響，內(nèi)毒素回收率在50%~200%范圍內(nèi)。結(jié)論：使用LAL進行動態(tài)濁度法定量檢測復方苦參注射液的細菌內(nèi)毒素是可行的，可用細菌內(nèi)毒素方法代替兔熱原檢查法，同時又避免了限量法內(nèi)毒素檢測時的干擾。
關(guān)鍵詞：復方苦參注射液；細菌內(nèi)毒素；動態(tài)濁度法；干擾試驗；美洲鱟試劑

復方苦參注射液又名巖舒注射液 (compound Kusheninjection, CKI)，是由苦參、白土苓兩味藥經(jīng)

提取加工精制而成的純中藥制劑，收載于衛(wèi)生部藥品標準^[1]，具有清熱利濕、涼血解毒、散結(jié)止痛之功

效。現(xiàn)代研究表明其具有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、提高機體免疫力等多種藥理作用，臨床上廣泛用于非小

細胞肺癌、原發(fā)性肝癌、消化道癌及惡性胸腔積水等重癥疾病的輔助治療^[3-8]。目前我國藥品標準對復方苦參注射液采用家兔法進行熱原檢查。但家兔熱原檢查操作復雜，影響因素多，而細菌內(nèi)毒素限量檢查又具有較大的干擾性^[9]，故選用動態(tài)濁度法測定其細菌內(nèi)毒素以消除其干擾，結(jié)果準確可靠。而目前對復方苦參注射液的檢測研究多基于東方鱟試劑TAL，基于美洲鱟試劑LAL的檢測鮮有報道，本文主要應用 LAL對復方苦參注射液進行動態(tài)濁度法檢測，同時所采用的儀器耗材均為美國 ACC產(chǎn)品，結(jié)果準確可靠，符合美國FAD相關(guān)標準，從而為復方苦參注射液的美國 FAD認證申報提供參考。

1 材料與儀器
復方苦參注射液(山西振東制藥股份有限公司)；LAL試劑(批號 516-06-789-T，λ=0.001EU·mL^-1，規(guī)格 5mL/瓶，美國 ACC公司)；細菌內(nèi)毒素工作標準品(批號 154,美國 ACC公司);細菌內(nèi)毒素檢查用水(批號 AB215748，規(guī)格 50mL/瓶，美國ACC公司)；PKF96細菌內(nèi)毒素檢測儀(美國 ACC公司)｡

2 方法與結(jié)果
2.1 細菌內(nèi)毒素限值的確定^[1]
公式為：L=K·M^-1，K為規(guī)定的給藥途徑，即人每公斤體重每 1h最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射
劑為 5.0 EU·kg^-1；本品的日靜脈注射量為 12mL，加入 0.9% 氯化鈉注射液 200mL中靜滴，靜注時間
按 1h計。中國人均體重按 60kg 計算，則 M為 1h每公斤體重人的最大給藥劑量為 0.2mL·kg^-1，計
算得樣品的內(nèi)毒素限值 L為 25 EU·mL^-1｡

2.2 標準曲線制備及可靠性^[2]
用細菌內(nèi)毒素檢查用水 LRW 將內(nèi)毒素工作標準品進行 5倍稀釋，最終細菌內(nèi)毒素濃度分別為
0.625､0.125､0.025､0.005､0.001EU·mL^-1稀釋系列；各取 0.1mL樣本分別加到反應管內(nèi)，后加入
0.1mL LAL 試劑并渦旋 1-2秒混合均勻,立即插入PKF96細菌內(nèi)毒素檢測儀內(nèi)進行自動檢測，其中每
一個濃度重復 3管｡  儀器自動繪制標準曲線,結(jié)果見圖 1。回歸方程：LgT=2.667-0.3029LgC其中相關(guān)系數(shù) r=-0.994；最低濃度 λ=0.001EU·mL^-1；空白對照管在檢測時間外,故標準曲線成立｡

圖 1 標準回歸曲線
Fig.1 Standard Curve

2.3 干擾試驗
2.3.1 樣品稀釋倍數(shù)計算^[3]
公式為:MVD=L·C·λ^-1｡L為復方苦參注射液內(nèi)毒素限值；C為1.0mL·mL^-1；λ為標準曲線的最低內(nèi)毒素濃度0.001EU·mL^-1；計算得復方苦參注射液最大有效稀釋倍數(shù) MVD為 25000倍(由于美國 ACC鱟試劑的靈敏度較高，λ值較低，故可稀釋倍數(shù)更大)｡

2.3.2 樣品溶液配制及干擾試驗
將復方苦參注射液用內(nèi)毒素檢查用水 LRW 依次稀釋為 200,400,500倍溶液，記為 A溶液；同時另取 3管，進行 100,200,250倍數(shù)稀釋，但在稀釋液中添加等體積濃度為 0.05 EU·mL^-1的細菌內(nèi)毒素工作標準品溶液；作為樣品添加內(nèi)毒素陽性對照管，記為 B溶液(經(jīng)此步操作保證 B溶液最終樣本稀釋倍數(shù)仍為 200､400､500倍,內(nèi)毒素工作標準品終濃度均為 0.025EU·mL^-1)；分別取上述各液 0.1mL，加入預先加
有 0.1mL LAL 試劑的反應管內(nèi), 渦旋 1-2s混勻立即插入 PKF96細菌內(nèi)毒素檢測儀內(nèi)進行檢測，其中每一個濃度重復 3管，儀器軟件會自動計算回收率｡
回收率 (%)=(B液內(nèi)毒素值-A液內(nèi)毒素值)/0.025×100%｡ 結(jié)果見表 1｡
標準曲線：LgT=2.667-0.3029 LgC  r=-0.994｡

樣品的添加內(nèi)毒素平均回收率均在 50% ~200%范圍內(nèi)，符合中國藥典 2015年版第四部及美國藥典 85 of USP 39 規(guī)定，表明樣品的 3個濃度溶液對鱟試劑 LAL均無干擾影響｡

2.4 樣品溶液定量試驗
分別取 4 批復方苦參注射液,用內(nèi)毒素檢查用水 LRW 依次稀釋為 200 倍溶液，記為 A溶液；同時另取 3管，進行 100倍數(shù)稀釋，但在稀釋液中添加等體積濃度為 0.05 EU·mL^-1的細菌內(nèi)毒素工作標準品溶液;作為樣品添加內(nèi)毒素陽性對照管，記為 B溶液(經(jīng)此步操作保證 B溶液最終樣本稀釋倍數(shù)仍為 200倍，內(nèi)毒素工作標準品終濃度均為 0.025 EU·mL^-1)；其中每個濃度重復 3管，計算回收率，結(jié)果見表 2。4批復方苦參注射液的回收率均在50% ~200%范圍內(nèi)，表明復方苦參注射液在本試驗條件下對 LAL 無干擾，因此日常檢驗選用 200倍稀釋液即可。結(jié)論：4批次復方苦參注射液內(nèi)毒素含量均符合規(guī)定｡

3 討論
3.1 干擾實驗符合藥典規(guī)定
從復方苦參注射液的干擾試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：復方苦參注射液用美洲鱟試劑 LAL進行細菌內(nèi)毒素動態(tài)濁度法檢測，由于內(nèi)毒素回收率在50%~200%范圍內(nèi)，表明不存在干擾因素影響，且 ４批復方苦參注射液（未超過 MVD的四個稀釋梯度）的內(nèi)毒素含量均在規(guī)定限度25 EU· mL^-1 以下。
 

表1 復方苦參注射液干擾實驗結(jié)果
Tab 1  Radix Sophora Flavescentis Injection interference test result

 

表 2 復方苦參注射液定量試驗
Tab.2  Radix Sophora Flavescentis Injection quantitive test

３.２ 動態(tài)濁度法可代替?zhèn)鹘y(tǒng)家兔法
用傳統(tǒng)的家兔法檢測細菌內(nèi)毒素，由于操作復雜，影響因素多，對試驗結(jié)果影響很大。利用美洲鱟試劑 LAL動態(tài)濁度法進行細菌內(nèi)毒素定量檢測，具有操作簡便，結(jié)果準確，檢測靈敏度高等優(yōu)點，尤其避免了由于家兔差異及人為主觀判斷所出現(xiàn)的假陽性或假陰性結(jié)果。經(jīng)過動態(tài)濁度法試驗，樣品的細菌內(nèi)毒素定量檢測各項結(jié)果均符合中國藥典 2015(四部)及美國藥典 85 of USP 39要求，說明使用美洲鱟試劑LAL 進行細菌內(nèi)毒素動態(tài)濁度法測定復方苦參注射液的細菌內(nèi)毒素是可行的，可代替?zhèn)鹘y(tǒng)家兔熱原檢查法。

３.３ 實驗結(jié)果可追蹤充分保證數(shù)據(jù)完整性

實驗中所有實驗數(shù)據(jù)均可進行審計追蹤，美國 ACC內(nèi)毒素檢測儀配套軟件Pyros EQSv1.2經(jīng)美國FDA認證，配備有oracle數(shù)據(jù)庫，能夠提供強大的審計追蹤功能，充分保證數(shù)據(jù)完整性及安全性。便于今后復方苦參注射液美國 FDA的認證申報。

參考文獻
[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準 .14冊[S]. 1995: 中藥成方制劑，WS3-B-2752-97 Drug Standard of Ministry of Public Health of the Peoples Republic of China [S]. Vol.14.1995: Chinese patent medicine. WS3-B-2752-97
[2] 中國藥典[S]. 2015年版. 四部：生物檢查法 1143ChP[S]. 2015.VolⅣ：Bioassay method1143
[3] 李春梅. 復方苦參注射液的臨床應用[J]. 疾病監(jiān)測與控制雜志. 2010, 14(6):330
Li Chunmei. The injection on clinical application of compound sophora [J]. Dis Monitor Control. 2010, 14(6):330
[4] 夏樂敏. 復方苦參注射液治療惡性腫瘤的臨床研究進展[J]. 中國腫瘤臨床與康復, 2011,18(4): 365
Xia Lemin. Clinical research progress of compound Sophora Injection in the treatment of malignant tumor[J]. Chin J Clin Oncol Rehabil, 2011, 18(4): 365
[5] 吳薏婷. 藥盒灌注復方苦參注射液聯(lián)合TACE治療肝癌的臨床研究[J]. 中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志, 2005, 11(3): 233
WU Yiting. Clinical study of compound Sophora Injection combined with TACE in the treatment of liver cancer[J]. Chin J Basic Med Tradit Chin Med, 2005, 11(3): 233
[6] 許剛,王穎,徐景明. 復方苦參注射液治療癌癥疼痛[J]. 前衛(wèi)醫(yī)藥雜志,1999,16(1):31
Xu Gang, Wang Ying, Xu Jing ming. Treatment of cancer pain with Compound Sophora Injection[J]. Qianwei J Med,1999,16(1):31
[7] 胡和平,陳貴明. 復方苦參注射液治療晚期惡性腫瘤 56例[J]. 臨床醫(yī)藥實踐, 2003,12(6):440
Hu Heping, Chen Guiming. Treatment of 56 cases of advanced malignant tumor with Compound Sophora Injection[J]. ProcClin Med,2003,12(6):440
[8] 宣麗君. 復方苦參注射液對化療減毒作用的臨床觀察[J]. 實用中醫(yī)內(nèi)科雜志,2005,19(3):275
Xuan Lijun. Clinical observation of Compound Sophora Injection on chemotherapy toxicity [J]. J Pract Tradit Chin Intern Med,2005,19(3):275
[9] 宋曉坤,李利娟. 5種中藥注射液細菌內(nèi)毒素檢測方法的建[J]. 中草藥,2006,37(12):1819
Song Xiaokun, Li lijuan. Establishment of bacterial endotoxin test for 5 kinds of traditional Chinese medicine injection[J]. Chin Tradit Herb Drugs,2006,37(12):1819