“為什么很難用臺(tái)盼藍(lán)染色劑來計(jì)數(shù)PBMC！有大的，小的，成團(tuán)的……；你能告訴我怎么在未染色的細(xì)胞中挑出有核細(xì)胞？”小編經(jīng)常被問到各種各樣關(guān)于如何計(jì)數(shù)PBMC的問題，今天就借此機(jī)會(huì)跟大家分享一下。
 
首先，了解下人類PBMCs的組成

      外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood monoculear cell, PBMC),大部分都是淋巴細(xì)胞，包括B細(xì)胞和T細(xì)胞，其中CD3 T細(xì)胞又占了淋巴細(xì)胞中絕大部分(45-70%)。相對(duì)于淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞的比例在10-30%，受到刺激之后會(huì)發(fā)育成樹突狀細(xì)胞(DC)或巨噬細(xì)胞。干細(xì)胞的比例非常低，只有0.1-0.2%。紅細(xì)胞和血小板沒有核，主要負(fù)責(zé)運(yùn)送氧。
 

 

傳統(tǒng)計(jì)數(shù)PBMCs的方法

     原代細(xì)胞，對(duì)于傳統(tǒng)的計(jì)數(shù)方法，絕對(duì)是一種挑戰(zhàn)！原代細(xì)胞懸液中包含各種異質(zhì)性的細(xì)胞類型和在消化過程中產(chǎn)生的細(xì)胞碎片。而且，因?yàn)闃悠凡杉�的部位不同，來源的病人不同，以及分離過程中的差異，樣品往往千差萬別。PBMC研究要求精確地判斷細(xì)胞死活，數(shù)量等等，對(duì)于進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)非常重要。
 
     在傳統(tǒng)的血球計(jì)數(shù)板+顯微鏡模式下，很難把PBMC細(xì)胞和紅細(xì)胞分開來。PBMC細(xì)胞在光鏡下，和腫瘤細(xì)胞相比很小，紅細(xì)胞兩面凹的形態(tài)，只能通過經(jīng)驗(yàn)和更加靈敏清晰的顯微鏡進(jìn)行人為識(shí)別。因此引入太多的人為因素，而導(dǎo)致誤差極大，也會(huì)使操作者疲憊不堪。

      因此有研究人員嘗試用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行PBMC的死活的鑒定。臺(tái)盼藍(lán)是組織和細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的死細(xì)胞鑒定染色方法之一。活細(xì)胞不會(huì)被染成藍(lán)色，而死細(xì)胞會(huì)被染成淡藍(lán)色。    PBMC分離過程中，會(huì)有紅細(xì)胞的殘留，雖然紅細(xì)胞沒有核，但是大小與PBMC接近；因?yàn)榘�膜完整，所以紅細(xì)胞也不會(huì)被染成藍(lán)色，因此傳統(tǒng)臺(tái)盼藍(lán)方法不能分辨紅細(xì)胞與活的PBMC，紅細(xì)胞也將被誤認(rèn)為是PBMC細(xì)胞，影響PBMC的活率和活細(xì)胞總數(shù)。

另外，PBMC實(shí)驗(yàn)還有其自身的特點(diǎn)：1. 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞質(zhì)量下降；2. 許多單細(xì)胞測(cè)序的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，需要快速準(zhǔn)確計(jì)數(shù)細(xì)胞死活和判斷細(xì)胞結(jié)團(tuán)情況，決定樣本是否適合上機(jī)檢測(cè)。所以，快速計(jì)數(shù)，并得到準(zhǔn)確的結(jié)果是保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的關(guān)鍵。
 
精準(zhǔn)的熒光計(jì)數(shù)法

      公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)法采用AO/PI染料雙染細(xì)胞核來檢測(cè)細(xì)胞的狀態(tài)。AO/PI試劑由可以發(fā)出綠色熒光的DNA結(jié)合染料吖啶橙（AcridineOrange，簡(jiǎn)稱AO）和可以發(fā)出紅色熒光的DNA結(jié)合染料碘化丙啶（Propidiumiodide，簡(jiǎn)稱PI）組成。其中AO可以通過完整的細(xì)胞膜，嵌入所有細(xì)胞（活細(xì)胞和死細(xì)胞）的細(xì)胞核，呈現(xiàn)綠色熒光；PI只能通過不完整的細(xì)胞膜，即死細(xì)胞的細(xì)胞膜，嵌入所有死細(xì)胞的細(xì)胞核，呈現(xiàn)紅色熒光。

      當(dāng)兩種染料均存在于細(xì)胞核內(nèi)，在合適的AO、PI配比下，兩種染料發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，死細(xì)胞在綠色通道下激發(fā)出紅色熒光。由于AO和PI為DNA結(jié)合染料，因此可有效排除雜質(zhì)以及紅細(xì)胞的干擾，確保對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。
 

 

上圖為我們使用美國(guó)DeNovix公司的CellDrop FL 熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀采用AO/PI染料，10秒內(nèi)即可完成對(duì)PBMCs的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。

建議

      所以，就不要再用明場(chǎng)或是借助臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行PBMCs細(xì)胞死活計(jì)數(shù)了。用AO/PI染料結(jié)合熒光計(jì)數(shù)儀，才是PBMCs精確計(jì)數(shù)和活力分析的金標(biāo)準(zhǔn)。