無論是2003年的SARS病毒還是2019年來勢洶洶的新冠肺炎病毒COVID-19，其實它們本身并不那么可怕，可怕的是我們不知道這些病原體是怎么攻擊宿主細胞并導致發病的，我們怎么才能阻止它們迫害宿主細胞 。
 

細胞內病原體根據對宿主細胞資源的依賴程度，它們可分為兩類：兼性和專性細胞內病原體。病毒、弓形蟲等專性細胞內病原體需要宿主細胞才能繁殖，而單核細胞增生李斯特菌等兼性細胞內病原體可以在細胞內或細胞外存活。
 

宿主-病原體相互作用是用來描述傳染源如何在宿主生物體內生存的術語。
 

為了在細胞水平上了解宿主-病原體的相互作用，我們需要克服常規顯微鏡方法的局限性，例如無法獲得三維信息或進行長期活細胞成像，以避免光毒性和圖像質量受損。
 

Nanolive公司的 3D Cell Explorer(3D CX)提供的無標記、無損傷數字成像技術，可以減少樣品制備時間，在獨特的高時空分辨率（<167nm；1img/1.7sec）下進行高質量的活細胞成像，無光漂白或光毒性問題。可對從病毒到細菌、寄生蟲等各種病原體從侵入到在細胞內復制繁殖等過程進行實時無標記3D成像追蹤及定量分析，下面請跟著我們的腳步來一起來觀賞那些驚人的生物過程。
 

微生物
 

Nanolive無標記全息顯微鏡揭示病毒誘導的活細胞病變作用
 

這個研究來自蘇黎世大學的格雷伯小組 ，3D CX被他們描述為唯一可用于無標記實時檢測病毒誘導活細胞病變效應的顯微成像解決方案。
 

細胞病變效應（CPEs）是感染的標志，可通過相差顯微鏡或熒光顯微鏡觀察到，但存在光毒性。3D CX數字全息斷層顯微術可無標記非干擾式觀測病毒感染活細胞的不同模式 ，通過測量RI和計算折射率梯度（RIG）值，揭示病毒感染后細胞的光學異質性。據此他們發現痘苗病毒（VACV）、單純皰疹病毒（HSV）和鼻病毒（RV）的感染呈漸進性和明顯增加趨勢。VACV而非HSV和RV感染會誘導細胞體積波動，且三種病毒均改變了細胞質膜動力學，誘導的細胞凋亡特征類似于化合物staurosporin，同時具有病毒特異性特征。因此3D CX作為定量無標記顯微鏡在感染研究中可在最小干擾下揭示活細胞中病毒類型特異性變化和細胞病變效應
 

publication：https://msphere.asm.org/content/3/6/e00599-18
 

Nanolive無標記實時觀測中性粒細胞吞噬肺炎細菌
 

下面這個獨特的無標記視頻來自烏特勒克的UMC感染和免疫實驗室利用3D CX做的肺炎細菌相關研究的DEMO 實驗。
 

肺炎是一種急性呼吸道感染 ，主要是由細菌或病毒引起的，也可能由真菌和寄生蟲引起。通常分離到引起肺炎的細菌是肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎衣原體和肺炎支原體[2]，這些只導致50%左右的肺炎病例[2]。另一方面，病毒性肺炎通常是由犀牛病毒、冠狀病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和副流感[3.4]引起的。最近，一種新的病毒SARS冠狀病毒2爆發，這種新的病毒感染個體導致肺炎， 這就是通常所說的COVID-19，已經被世衛組織宣布為國際關注的突發公共衛生事件[5]
 

肺炎感染的免疫機制因疾病的病因不同而不同。在病毒感染中，單核細胞通常與炎癥相關[6]，而在細菌感染中，中性粒細胞是疾病進展的關鍵[7]
 

通過3D Cell Explorer，可以清晰的看到培養的中性粒細胞吞噬肺炎細菌的過程。并可我們可以清楚地區分中性粒細胞的不同結構，從多分裂核到吞噬過程形成的吞噬體等。

李斯特菌感染小鼠巨噬細胞無標記動態分析
 

單核細胞增生李斯特菌感染是一種食源性細菌性疾病，對孕婦和免疫系統受損的人可能非常嚴重，對未出生的嬰兒和非常小的嬰兒是致命的。李斯特菌感染可通過食用保存不良的肉類和未經高溫消毒的乳制品（包括軟奶酪、冰淇淋和酸奶）而感染。并具有很強的抗藥性，可以在冷藏甚至冷凍條件下存活。
 

在這段視頻中，我們觀察了感染單核細胞增生李斯特菌的小鼠巨噬細胞。
 

視頻鏈接：https://v.youku.com/v_show/id_XNDYwMDQ4NjI3Ng==.html?spm=a2hzp.8244740.0.0
 

在視頻開始時，視野頂部的細胞正在經歷有絲分裂。在細胞中心可以清楚地看到染色體的凝聚。在同一宿主細胞中可以觀察到李斯特菌：它們要么在細胞質中自由移動，要么在細胞質液泡內復制。當宿主細胞分裂時，我們可以觀察到這些病原菌向子細胞的傳播。
 

在視頻的第二部分，在其生殖細胞周期結束時，李斯特菌通過宿主細胞的質膜釋放出來，可以自由感染其他細胞。并且3D Cell Explorer無標記成像方式還可清楚地看到李斯特菌定位在液泡中，隨后在釋放過程中膜破壞和細胞死亡。
 

巨噬細胞吞噬大腸桿菌
 

巨噬細胞幾乎存在于所有組織中。它們有助于健康機體的各種過程，如發育、傷口愈合、感染和組織內穩態。巨噬細胞以其典型的抗菌吞噬細胞功能而聞名，但也通過抗原的表達來支持免疫功能。它們在各種體外檢測研究領域中被應用于，如免疫學、細菌學和寄生蟲學 ，以及生物醫學和移植研究。
 

這個3D CX獲得的視頻展示了人M1巨噬細胞吞噬大腸桿菌的過程 。3D Cell Explorer能夠對這些活巨噬細胞以一個新的，無標記的方式成像，并觀測到膜皺褶，偽足前沿產生的波浪以中心花瓣的方式移向主體細胞的整個過程。
 

視頻鏈接：https://v.youku.com/v_show/id_XNDYwMDQ4ODE0NA==.html?spm=a2hzp.8244740.0.0
 

另外可以觀測到橢圓形顆粒的大腸桿菌顆粒被細胞捕獲，運輸和裂解。Nanolive可為吞噬功能激活劑和/或抑制劑及Toll樣受體（TLR）配體的篩選提供可靠的系統。
 

貝氏菌感染改變宿主內皮細胞內源性膽固醇從頭合成和外源性低密度脂蛋白攝取【10】
 

貝氏菌是歐洲一種新興的寄生蟲，引起牛貝氏病，一種對養牛業造成重大經濟影響的疾病。

與弓形蟲類似，貝氏桿菌也需要清除宿主細胞中的膽固醇才能進行復制。然而，貝氏桿菌獲取膽固醇的機制仍然存在爭議。

在這項工作中，席爾瓦和來自吉森大學Justus Liebig大學的同事通過分析體內牛原代內皮細胞的貝斯菌感染來研究膽固醇挽救模型。

他們的結果表明，貝氏桿菌可以通過內源攝取而不是外源攝取獲得膽固醇。這一發現強化了一種理論，即牛內皮原代宿主細胞中成功的貝氏桿菌感染依賴于寄生蟲和細胞類型。

3D Cell Explorer- fluo- 用于證實了貝氏桿菌感染細胞中存在豐富的脂滴狀結構。隨后使用STEVE軟件對圖像進行分析（圖1）。
 

圖 1. Live cell holographic tomography-based illustration of lipid droplets in non-infected and B. besnoiti- infected BUVEC.

未完待續……

敬請期待：Nanolive新冠肺炎疫情篇---一起聊聊病原微生物迫害宿主細胞的那些事（下篇）！