ATF的補料分批/灌流混合工藝在病毒疫苗生產(chǎn)的應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：5160　發(fā)布日期：2020-3-20　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負

使用基于ATF的補料分批/灌流混合工藝進行病毒疫苗生產(chǎn)

來自德國馬克斯·普朗克復(fù)雜技術(shù)系統(tǒng)動力學(xué)研究所和ProBioGen AG等的科學(xué)家們在2019年第103期的《Applied Microbiology and Biotechnology》雜志上發(fā)表了題為“High titer MVA and influenza A virus production using a hybrid fed-batch/perfusion with an ATF system”的文章。文中，研究人員提出了一種在高細胞密度工藝中提高MVA（修飾的安卡拉痘苗病毒）產(chǎn)率的培養(yǎng)策略。該策略基于此前研究人員在搖瓶培養(yǎng)中開發(fā)的方法，在臺式生物反應(yīng)器中建立，包括AGE1.CR.plX細胞在化學(xué)限定培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)至高細胞密度，然后以MVA-CR19病毒株感染。首先，建立灌流策略，以優(yōu)化細胞生長階段。其次，初始感染階段選擇補料分批策略，以促進病毒攝入和細胞間的傳播。最后，再切換為灌流，為病毒增殖晚期連續(xù)提供營養(yǎng)物。該補料分批/灌流混合策略獲得最大感染性滴度為1.0 x 10^10 IU/mL，相比傳統(tǒng)批次培養(yǎng)，產(chǎn)物滴度可提高一個數(shù)量級。最后，從生產(chǎn)滅活疫苗考慮，將該策略用于生產(chǎn)流感A/PR/8/3（H1N1）病毒，使用相同的培養(yǎng)系統(tǒng)，可達到3.8 × 10^10 virions/mL的總數(shù)。總體來講，使用相同的系統(tǒng)，可獲得與傳統(tǒng)批次培養(yǎng)相當或更高的細胞特異性病毒產(chǎn)量和單位體積產(chǎn)率。此外，大多數(shù)病毒顆粒在培養(yǎng)上清中，可簡化下游操作，特別是MVA病毒。研究人員總結(jié)認為該策略有助于新的病毒疫苗生產(chǎn)方法的開發(fā)。

實驗：生物反應(yīng)器培養(yǎng)

CR.pIX細胞以0.8-10^6cells/mL的密度接種1L 臺式生物反應(yīng)器，工作體積0.6-0.8L。生物反應(yīng)器操作條件設(shè)置為37℃、pH 7.2、攪拌速度 120-160rpm，以20μm微泡控制DO為40%。細胞開始以批次模式培養(yǎng)，當葡萄糖濃度達到14-17mM時（接種后60-72h），開始灌流。灌流使用XCell ATF 2系統(tǒng)，以C24控制器控制，流速設(shè)置為1.0L/min，并以確定的灌流速率進行操作，以達到＞25 x 10^6cells/mL的細胞密度。

在細胞生長階段，灌流速率每12或24h手動調(diào)節(jié)。操作時，離線檢測活細胞密度，計算取樣時間點的相應(yīng)流速，確保CSPR為0.06nL/cell/day，這是CR.pIX細胞基于其葡萄糖消耗速率的最佳置換速率。根據(jù)最高細胞特異性生長速率μ=0.026h-1，計算12或24h后的預(yù)期活細胞密度和相應(yīng)的灌流速率。使用BIOSTAT B plus模塊的級聯(lián)控制，可獲得采樣時間點之間的線性曲線。感染前2h，使用ATF系統(tǒng)，以新鮮培養(yǎng)基置換1個反應(yīng)器體積。

培養(yǎng)置換后，生物反應(yīng)器感染MVA-C19或流感A病毒A/PR/8/34（H1N1）。對于MVA-CR19病毒，使用2種補液程序加上灌流程序，命名為混合工藝1和混合工藝2，以優(yōu)化在高細胞密度條件下的病毒增殖。對于混合工藝1，廢棄部分細胞懸液，以0.3L的細胞懸液開始病毒生產(chǎn)階段。病毒感染后，加入0.15L新鮮培養(yǎng)基，立即開始補料分批，在感染后12h再補液0.15L，感染后24小時，補液0.3L。最后，在感染后36-120h，以1vvd的速率進行灌流。病毒顆粒（200-400 nm）使用與細胞生長階段相同的ATF中空纖維組件進行收獲。相似的，對于混合工藝2，在病毒感染后立即補液0.2L，之后在感染后24h，補液0.25L，最后，在感染后36-120h，以1vvd的速率進行灌流。為提高病毒收獲，在感染后36小時，將細胞生長階段使用的0.2μm中空纖維組件替換為新的更大孔徑組件。對于流感病毒A生產(chǎn)，評估了一種與MVA-CR19病毒相似的混合策略。

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原文：D.Vazquez-Ramirez, I.Jordan, V.Sandig, High titer MVA and influenza A virus production using a hybrid fed-batch/perfusion with an ATF system. Applied Microbiology and Biotechnology, 2019, 103: 3025-3035.